Una prova di cellule staminali autologhe derivate dal midollo osseo nell'insufficienza cardiaca pediatrica

Questo studio pilota ha un disegno randomizzato, crossover, controllato con placebo. La dichiarazione CONSORT (Consolidated Standards of Reporting Trials) è stata utilizzata per guidare lo sviluppo del protocollo. L'approvazione etica è stata ottenuta per questo progetto nell'aprile 2008.

È stato prodotto un diagramma di flusso CONSORT e progettato un piano di progetto per uno studio incrociato. Sebbene l'endpoint primario dello studio fosse la sicurezza e la fattibilità, il ricercatore mirava a considerare l'esito funzionale come endpoint secondario. La revisione statistica della letteratura disponibile ha indicato che una variazione del 3% nella frazione di eiezione (FE) misurata mediante risonanza magnetica (MRI) rappresenterebbe un cambiamento significativo e ha calcolato che 10 pazienti sarebbero sufficienti per rilevare questa variazione media della FE, assumendo una SD di differenza del 3% con l'80% di potenza e il 5% di significatività. Per tutti i calcoli si è ipotizzato che la distribuzione delle differenze fosse Normale. Il calcolo della dimensione del campione per lo studio crossover richiedeva una definizione della differenza minima da rilevare.

Saranno invitati a partecipare allo studio i bambini di età compresa tra 1 anno e 16 anni al momento della revisione, che frequentano la clinica per l'insufficienza cardiaca presso il Great Ormond Street Hospital (GOSH) o inviati per l'ammissione e la gestione della loro insufficienza cardiaca al GOSH. Il limite di età inferiore è stato selezionato per consentire l'esecuzione fattibile del cateterismo coronarico tenendo conto delle dimensioni del paziente.

All'arruolamento tutti i pazienti hanno una funzione sistolica compromessa come determinato dalla ridotta frazione di accorciamento all'ecocardiogramma (più di 2 SD al di sotto del normale). Lo stato funzionale dei pazienti reclutati era di classe 2-4 come definito dalla classificazione NYHA o Ross.

I criteri di esclusione erano la necessità di un'elevata dipendenza o terapia intensiva e malattie cardiache congenite, infezione virale che precludeva l'uso delle strutture ospedaliere del laboratorio di terapia cellulare, tumori maligni attivi e terapia farmacologica cardiaca instabile.

I potenziali pazienti saranno identificati dalle note del caso e loro e le loro famiglie si sono avvicinati telefonicamente o dopo una revisione clinica per valutare il loro interesse a partecipare. A tutti i pazienti che si sono mostrati interessati a partecipare allo studio verranno fornite informazioni scritte appropriate relative all'età e alla lingua; e ha anche fornito un numero di telefono di contatto in modo che ulteriori informazioni possano essere fornite se necessario. Ogni famiglia avrà l'opportunità di discutere lo studio con il gruppo di ricerca prima che fosse ottenuto il consenso per l'inclusione.

Protocollo:

Dieci pazienti che hanno soddisfatto i criteri di ammissibilità saranno reclutati per questo studio. Ogni paziente viene randomizzato all'ingresso nello studio per determinare se riceverà cellule staminali al Periodo Uno o al Periodo Due del protocollo. La randomizzazione è stata eseguita utilizzando una tabella di numeri casuali generata dal computer, Graph pad.

Dopo il reclutamento e la randomizzazione, i pazienti hanno pianificato la loro tempistica di ricovero individuale. I pazienti che riceveranno cellule staminali al loro primo ricovero nello studio vengono rivisti entro i 28 giorni precedenti tale data. In questa revisione, verrà eseguito lo screening per l'infezione, come da protocollo del nostro laboratorio di terapia cellulare dell'ospedale (inclusi HIV ed epatite B e C), previo pieno consenso scritto.

Il giorno della procedura il paziente sarà ricoverato presso la struttura diurna cardiaca per le osservazioni di base e la valutazione clinica. La procedura di studio verrà eseguita nel teatro di risonanza magnetica cardiaca in anestesia generale. I campioni di sangue verranno prelevati al momento dell'anestesia per le indagini di routine (emocromo completo, urea, elettroliti, funzionalità epatica e NTproBNP).

I pazienti che ricevono cellule staminali intracoronariche a questo ricovero hanno 20 ml di midollo osseo aspirato dalla cresta iliaca posteriore in condizioni asettiche immediatamente dopo l'induzione dell'anestesia.

Tecnica di aspirazione del midollo osseo:

I pazienti in terapia anticoagulante sono evidenziati prima di tutte le procedure e i ricoveri e la gestione ottimale della coagulazione implementata prima, durante e dopo l'aspirazione del midollo osseo. Tutta la lavorazione del midollo osseo viene effettuata presso la struttura di elaborazione della terapia cellulare del Great Ormond Street Hospital.

Dopo l'induzione dell'anestesia e la messa in sicurezza di una via aerea stabile, il paziente viene posizionato in modo da consentire l'aspirazione del midollo osseo. Le condizioni asettiche complete sono osservate durante tutta la procedura. Un volume di 20 ml di midollo osseo viene aspirato da un singolo sito di puntura dell'ago utilizzando siringhe eparinizzate da 10 ml attaccate all'ago del midollo osseo dopo la rimozione del trocar centrale. Il midollo osseo aspirato viene trasferito in flaconi per campioni universali sterili eparinizzati. Immediatamente dopo l'aspirazione, il campione di midollo osseo viene portato al laboratorio di terapia cellulare per la separazione delle cellule mononucleari utilizzando tecniche standard di centrifugazione a gradiente.

Il protocollo di separazione delle cellule mononucleari richiede circa 90 minuti per essere completato. Il campione di midollo osseo viene elaborato per fornire 1 ml per l'iniezione intra-coronarica e 1 ml da congelare criogenicamente per un'ulteriore analisi fenotipica in un secondo momento. Una piccola aliquota di sospensione di cellule staminali viene analizzata per ottenere la conta totale delle cellule mononucleate per millilitro. Questa conta cellulare rappresenta il numero totale di cellule mononucleate iniettate tramite cateterismo intracoronarico. Inoltre è stata valutata anche la vitalità cellulare.

In attesa delle cellule staminali preparate, la risonanza magnetica cardiaca viene eseguita utilizzando un protocollo di apnea per l'acquisizione delle immagini. Dopo la scansione MRI il paziente viene trasferito per mezzo del tavolo scorrevole meccanizzato nella sala angiografica.

Al ritorno alla sala angiografica, il paziente viene mantenuto in anestesia generale fino a quando non viene comunicato dal laboratorio di cellule staminali che il trattamento delle cellule staminali è in fase di completamento. In seguito al contatto con il laboratorio di cellule staminali, una guaina arteriosa viene inserita nell'arteria femorale del paziente dello studio e fatta avanzare finché la sua punta non si trova nell'arteria coronaria principale sinistra. È stata osservata un'occlusione parziale dell'arteria coronaria come dimostrato dai cambiamenti del segmento ST e lo smorzamento del tracciato della pressione viene regolarmente monitorato durante tali procedure. Il volume di 1 ml viene iniettato lentamente attraverso il catetere coronarico nell'arteria coronaria principale sinistra, seguito da un lavaggio con soluzione salina allo 0,9% da 1 ml per un periodo di 2 minuti.

Dopo l'iniezione intracoronarica della sospensione di cellule staminali, il catetere cardiaco viene rimosso e si ottiene l'emostasi nel sito di ingresso della pelle. Il paziente viene quindi svegliato e recuperato in modo standard.

I pazienti vengono ricoverati in reparto cardiologico durante la notte con monitoraggio di routine del sito di accesso al cateterismo arterioso e del sito di aspirazione del midollo osseo; le osservazioni sulla cura cardiaca sono continuate per tutto il tempo. I pazienti vengono dimessi il giorno successivo e rivisti elettivamente nella clinica ambulatoriale tre mesi dopo la procedura o viene consigliato di contattare prima il ricercatore in caso di dubbi.

Il crossover degli interventi avviene a sei mesi con il gruppo di cellule staminali che riceve placebo tramite cateterizzazione cardiaca (non è richiesto il prelievo di midollo osseo per il braccio placebo dello studio) nella seconda occasione. Lo stesso ricovero, monitoraggio e follow-up saranno organizzati come per la fase delle cellule staminali dello studio. Il placebo utilizzato per l'iniezione intracoronarica utilizzata è 1 ml di soluzione fisiologica allo 0,9%, coerente con la soluzione placebo utilizzata negli studi sugli adulti. L'1 ml di placebo è seguito da un lavaggio con soluzione salina allo 0,9% da 1 ml per la correlazione con il braccio delle cellule staminali dello studio. Una revisione clinica ad interim viene nuovamente organizzata tre mesi dopo la procedura e una risonanza magnetica cardiaca di follow-up a sei mesi. La scala temporale è stata scelta dopo aver rivisto la letteratura disponibile per adulti, che ha mostrato che gli effetti sul ventricolo sinistro si osservavano generalmente entro 6 mesi.

Quei pazienti assegnati in modo casuale al placebo nella prima fase dello studio passano per ricevere cellule staminali nella seconda fase. Le modalità di follow-up intermedio e finale sono le stesse per i gruppi di cellule staminali e placebo.

L'anestesia è stata standardizzata per tutti i pazienti e lo stesso anestesista utilizzato per tutte le procedure. Anche la preparazione del midollo osseo è stata standardizzata ed eseguita dallo stesso scienziato in ciascun caso. L'inserimento dei dati informatici sarà ricontrollato. Gli identificatori dei pazienti vengono rimossi dalle immagini anonime per consentire un'analisi cieca in seguito; in questo modo viene eseguita un'analisi imparziale dell'immagine. Un singolo ricercatore che utilizza il software Osirix esegue l'analisi off-line dei dati. Come secondo controllo di questi dati, i risultati del ricercatore vengono valutati, ancora una volta ciechi agli identificatori del paziente, da un secondo analizzatore. La chiave per l'accecamento dei dati MRI è ideata, applicata e archiviata in modo sicuro da un medico non altrimenti coinvolto nello studio. I valori indicizzati correggono i dati per età, sesso, altezza e peso e consentono di effettuare confronti reali tra le serie di studi dello stesso individuo e tra individui diversi.

Misure di esito primarie:

Le misure di esito primarie erano l'assenza di morte e trapianto o qualsiasi complicazione che potesse essere considerata correlata all'iniezione di midollo osseo o all'anestesia (infezione/malignità/anafilassi/deterioramento renale). Verrà istituito un comitato di monitoraggio della sicurezza, comprendente un cardiologo del Great Ormond Street Hospital non coinvolto nella sperimentazione, un cardiologo esterno e un rappresentante laico. Eventuali eventi avversi saranno segnalati al comitato che aveva il potere di interrompere il processo in qualsiasi momento in caso di dubbi.

Misure di esito secondarie:

La frazione di eiezione, i volumi del ventricolo sinistro e la massa sono derivati ​​dalla RM cardiaca. Il sangue viene prelevato per NT proBNP. Inoltre lo stato funzionale è valutato dalla classificazione della New York Heart Association o dalla classificazione di Ross nei bambini più piccoli.

Ogni paziente ha una risonanza magnetica cardiaca in anestesia generale. Il protocollo dell'anestesista e dell'anestesia è lo stesso per tutti i pazienti.

Tutte le immagini sono ottenute con uno scanner MR da 1,5 T (Avanto, Siemens, Erlangen, Germania) utilizzando una bobina phased-array a 12 elementi per la ricezione del segnale e la bobina del corpo per la trasmissione del segnale. Un sistema ECG vettoriale viene utilizzato per il gating cardiaco.

I volumi del ventricolo sinistro (LV) sono misurati dal cine contiguo di precessione libera allo stato stazionario contiguo che copre entrambi i ventricoli (7-13 fette, a seconda delle dimensioni del bambino). Ogni fetta viene acquisita in una singola trattenuta del respiro da 10 a 15 secondi come descritto in precedenza. Tutta l'elaborazione delle immagini viene eseguita utilizzando plug-in interni per il software open source Osirix DICOM (imaging digitale e comunicazioni in medicina). Il volume telediastolico LV (EDV) e il volume telesistolico (ESV) sono misurati mediante segmentazione manuale dei bordi endocardici nei dati dell'asse corto. Viene eseguita un'attenta segmentazione delle fette basali in combinazione con le viste a 4 camere e dell'asse lungo LV per superare i problemi con la delineazione della valvola mitrale. Il volume sistolico ventricolare (SV) era la differenza tra EDV ed ESV e la frazione di eiezione ventricolare (%) era (SV/EDV)×100.

Per ciascuno degli endpoint secondari, EDV, ESV e EF, i confronti tra i trattamenti vengono effettuati in base all'intenzione di trattare. Viene condotta un'analisi incrociata sulle misure post-trattamento utilizzando un modello di analisi della varianza, considerando la sequenza, il periodo e gli effetti del trattamento. L'effetto di trascinamento viene testato per primo e, laddove non vi siano prove di un effetto significativo, viene testato l'effetto del trattamento. È stato adattato un successivo modello di equazione di stima generalizzata (GEE) che ha consentito un aggiustamento per le misure di base.

Laddove la distribuzione dei dati era chiaramente non normale, i ricercatori utilizzano una trasformazione logaritmica. Stata viene utilizzato per tutte le analisi statistiche e tutti i test erano a due code. Un valore P <0,05 è stato considerato significativo.