Próba autologicznych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego w dziecięcej niewydolności serca

To badanie pilotażowe ma randomizowany, krzyżowy, kontrolowany placebo projekt. Do opracowania protokołu wykorzystano oświadczenie Consolidated Standards of Reporting Trials (CONSORT). W kwietniu 2008 r. dla tego projektu uzyskano aprobatę etyczną.

Opracowano schemat blokowy CONSORT i opracowano plan projektu badania krzyżowego. Chociaż pierwszorzędowym punktem końcowym badania było bezpieczeństwo i wykonalność, badacz starał się spojrzeć na wynik czynnościowy jako drugorzędowy punkt końcowy. Przegląd statystyczny dostępnej literatury wykazał, że zmiana frakcji wyrzutowej (EF) o 3% mierzona za pomocą rezonansu magnetycznego (MRI) stanowiłaby znaczącą zmianę i obliczono, że 10 pacjentów wystarczyłoby do wykrycia tej średniej zmiany EF, przy założeniu odchylenia standardowego wynoszącego różnica 3% z mocą 80% i istotnością 5%. We wszystkich obliczeniach przyjęto, że rozkład różnic jest normalny. Obliczenie wielkości próby do badania krzyżowego wymagało zdefiniowania minimalnej różnicy, która ma zostać wykryta.

Do udziału w badaniu zostaną zaproszone dzieci w wieku od 1 roku do 16 lat podczas przeglądu, uczęszczające do Kliniki Niewydolności Serca w Great Ormond Street Hospital (GOSH) lub skierowane na przyjęcie i leczenie niewydolności serca w GOSH. Dolną granicę wieku wybrano tak, aby cewnikowanie tętnicy wieńcowej było wykonalne przy uwzględnieniu wzrostu pacjenta.

W chwili rekrutacji wszyscy pacjenci mieli upośledzoną funkcję skurczową, co określono na podstawie zmniejszonej frakcji skracania w badaniu echokardiograficznym (więcej niż 2 SD poniżej normy). Stan funkcjonalny rekrutowanych pacjentów mieścił się w klasie 2-4 zgodnie z klasyfikacją NYHA lub Ross.

Kryteriami wykluczenia były: potrzeba intensywnej opieki lub niesamodzielności oraz wrodzona wada serca, infekcja wirusowa, która wykluczałaby korzystanie ze szpitalnego Laboratorium Terapii Komórkowej, aktywny nowotwór złośliwy i niestabilna terapia kardiologiczna.

Potencjalni pacjenci zostaną zidentyfikowani na podstawie notatek przypadków, a oni i ich rodziny zwrócą się do nich telefonicznie lub po przeglądzie kliniki, aby ocenić ich zainteresowanie udziałem. Wszyscy pacjenci, którzy zgłosili zainteresowanie udziałem w badaniu, otrzymają pisemną informację odpowiednią dla wieku i języka; a także numery telefonów kontaktowych, aby w razie potrzeby można było udzielić dodatkowych informacji. Każda rodzina będzie miała możliwość przedyskutowania badania z zespołem badawczym przed uzyskaniem zgody na włączenie.

Protokół:

Dziesięciu pacjentów, którzy spełnili kryteria kwalifikacji, zostanie zrekrutowanych do tego badania. Każdy pacjent jest przydzielany losowo przy wejściu do badania w celu ustalenia, czy otrzyma komórki macierzyste w pierwszym czy drugim okresie protokołu. Randomizację przeprowadzono przy użyciu wygenerowanej komputerowo tabeli liczb losowych, Graph Pad.

Po rekrutacji i randomizacji pacjenci mają zaplanowany indywidualny harmonogram przyjęć. Pacjenci, którzy mają otrzymać komórki macierzyste przy pierwszym przyjęciu do badania, są oceniani w ciągu 28 dni poprzedzających tę datę. Podczas tego przeglądu zostaną przeprowadzone badania przesiewowe w kierunku infekcji, zgodnie z protokołem naszego szpitalnego Laboratorium Terapii Komórkowej (w tym w kierunku HIV i wirusowego zapalenia wątroby typu B i C), po uzyskaniu pełnej pisemnej zgody.

W dniu zabiegu pacjent zostanie przyjęty do dziennego oddziału kardiologicznego w celu obserwacji wyjściowej i oceny klinicznej. Procedura badania zostanie przeprowadzona w sali rezonansu magnetycznego serca w znieczuleniu ogólnym. Próbki krwi zostaną pobrane w czasie znieczulenia do rutynowych badań (morfologia krwi, mocznik, elektrolity, czynność wątroby i NTproBNP).

Pacjenci otrzymujący wewnątrzwieńcowe komórki macierzyste przy tym przyjęciu mają aspirację 20 ml szpiku kostnego z tylnego grzebienia biodrowego w warunkach aseptycznych bezpośrednio po wprowadzeniu do znieczulenia.

Technika aspiracji szpiku kostnego:

Pacjenci poddawani terapii przeciwzakrzepowej są wyróżniani przed wszystkimi zabiegami i przyjęciami, a optymalne zarządzanie krzepliwością wdrażane przed, w trakcie i po aspiracji szpiku kostnego. Całe przetwarzanie szpiku kostnego odbywa się w zakładzie przetwarzania terapii komórkowej szpitala Great Ormond Street.

Po indukcji znieczulenia i zabezpieczeniu drożności dróg oddechowych pacjenta układa się tak, aby umożliwić aspirację szpiku kostnego. Podczas całej procedury przestrzegane są pełne warunki aseptyczne. Objętość 20 ml szpiku kostnego jest aspirowana z miejsca nakłucia pojedynczą igłą za pomocą heparynizowanych 10 ml strzykawek przymocowanych do igły szpiku kostnego po usunięciu centralnego trokara. Pobrany szpik kostny przenosi się do sterylnych heparynizowanych uniwersalnych butelek na próbki. Natychmiast po aspiracji próbka szpiku kostnego jest przekazywana do laboratorium terapii komórkowej w celu oddzielenia komórek jednojądrzastych przy użyciu standardowych technik wirowania w gradiencie.

Protokół separacji komórek jednojądrzastych trwa około 90 minut. Próbka szpiku kostnego jest przetwarzana w celu uzyskania 1 ml do wstrzyknięcia do naczyń wieńcowych i 1 ml do zamrożenia kriogenicznego do dalszej analizy fenotypowej w późniejszym terminie. Małą porcję zawiesiny komórek macierzystych analizuje się w celu uzyskania całkowitej liczby komórek jednojądrzastych na mililitry. Ta liczba komórek reprezentuje całkowitą liczbę komórek jednojądrzastych wstrzykniętych przez cewnikowanie wewnątrzwieńcowe. Ponadto oceniano również żywotność komórek.

W oczekiwaniu na przygotowane komórki macierzyste wykonuje się badanie MRI serca przy użyciu protokołu wstrzymania oddechu w celu uzyskania obrazu. Po wykonaniu rezonansu magnetycznego pacjent jest przenoszony za pomocą zmechanizowanego stołu przesuwnego z powrotem do pracowni angiografii.

Po powrocie na pracownię angiografii pacjent jest utrzymywany w znieczuleniu ogólnym do czasu powiadomienia laboratorium komórek macierzystych o zbliżającym się zakończeniu przetwarzania komórek macierzystych. Po kontakcie z laboratorium komórek macierzystych w tętnicy udowej badanego pacjenta umieszczana jest osłonka tętnicza i przesuwana aż do umieszczenia jej końcówki w lewej głównej tętnicy wieńcowej. Stwierdzono częściową niedrożność tętnicy wieńcowej, o czym świadczyły zmiany odcinka ST, a tłumienie śladu ciśnienia jest rutynowo monitorowane podczas takich zabiegów. Objętość 1 ml powoli wstrzykuje się przez cewnik tętnicy wieńcowej do lewej głównej tętnicy wieńcowej, po czym przepłukuje się 1 ml 0,9% roztworu soli fizjologicznej przez okres 2 minut.

Po dowieńcowym wstrzyknięciu zawiesiny komórek macierzystych cewnik sercowy jest usuwany i osiągana jest hemostaza w miejscu wprowadzenia przez skórę. Następnie pacjenta budzi się i wraca do zdrowia w standardowy sposób.

Pacjenci przyjmowani są na noc do oddziału kardiologicznego z rutynową kontrolą miejsca dostępu cewnikowania tętniczego i miejsca aspiracji szpiku kostnego; obserwacje kardiologiczne są kontynuowane przez cały czas. Pacjenci są wypisywani następnego dnia i planowo oceniani w ambulatorium po trzech miesiącach od zabiegu lub zaleca się im wcześniejszy kontakt z pracownikiem naukowym w przypadku jakichkolwiek wątpliwości.

Naprzemienne interwencje mają miejsce po sześciu miesiącach, gdy grupa komórek macierzystych otrzymuje placebo poprzez cewnikowanie serca (nie jest wymagane pobieranie szpiku kostnego w przypadku grupy otrzymującej placebo) przy drugiej okazji. Zostanie zorganizowane takie samo przyjęcie, monitorowanie i obserwacja, jak w przypadku etapu badania komórek macierzystych. Placebo użyte do wstrzyknięcia do naczyń wieńcowych to 1 ml 0,9% soli fizjologicznej, zgodnie z roztworem placebo stosowanym w badaniach z udziałem osób dorosłych. Po 1 ml placebo następuje przepłukanie 1 ml 0,9% soli fizjologicznej w celu korelacji z ramieniem badania z komórkami macierzystymi. Tymczasowy przegląd kliniki jest ponownie organizowany trzy miesiące po zabiegu, a kontrolne badanie MRI serca po sześciu miesiącach. Skalę czasową wybrano po dokonaniu przeglądu dostępnej literatury dla dorosłych, która wykazała, że ​​wpływ na lewą komorę był zwykle obserwowany w ciągu 6 miesięcy.

Ci pacjenci losowo przydzielili placebo na pierwszym etapie badania, aby otrzymać komórki macierzyste na drugim etapie. Tymczasowe i końcowe ustalenia dotyczące obserwacji są takie same dla grup otrzymujących komórki macierzyste i placebo.

Znieczulenie zostało wystandaryzowane dla wszystkich pacjentów, a do wszystkich zabiegów użyto tego samego anestezjologa. Przygotowanie szpiku kostnego było również standaryzowane i wykonywane w każdym przypadku przez tego samego naukowca. Wprowadzone dane komputerowe będą dwukrotnie sprawdzane. Identyfikatory pacjentów są usuwane z anonimowych obrazów, aby umożliwić późniejszą ślepą analizę; w ten sposób przeprowadzana jest obiektywna analiza obrazu. Pojedynczy badacz korzystający z oprogramowania Osirix przeprowadza analizę danych w trybie offline. W ramach drugiego sprawdzenia tych danych wyniki badacza są oceniane, ponownie ślepe na identyfikatory pacjentów, przez drugi analizator. Kluczem do zaślepienia danych MRI jest opracowanie, zastosowanie i bezpieczne przechowywanie przez klinicystę, który nie jest w inny sposób zaangażowany w badanie. Zindeksowane wartości korygują dane pod względem wieku, płci, wzrostu i wagi oraz umożliwiają dokonanie prawdziwych porównań między seriami badań tej samej osoby i między różnymi osobami.

Podstawowe miary wyniku:

Pierwszorzędowymi miarami wyniku były brak zgonu i przeszczepu lub jakiekolwiek powikłania, które można by uznać za związane z wstrzyknięciem szpiku kostnego lub znieczuleniem (zakażenie/nowotwór złośliwy/anafilaksja/pogorszenie czynności nerek). Powołana zostanie komisja monitorująca bezpieczeństwo, w skład której wejdą kardiolog z Great Ormond Street Hospital niezaangażowany w badanie, zewnętrzny kardiolog i przedstawiciel laików. Wszelkie zdarzenia niepożądane zostaną zgłoszone komisji, która była uprawniona do wstrzymania badania w dowolnym momencie, jeśli pojawią się obawy.

Miary wyników drugorzędowych:

Frakcja wyrzutowa, objętości i masa lewej komory pochodzą z MRI serca. Krew jest pobierana na NT proBNP. Dodatkowo stan funkcjonalny oceniany jest na podstawie klasyfikacji New York Heart Association lub klasyfikacji Rossa u młodszych dzieci.

Każdy pacjent ma wykonany rezonans magnetyczny serca w znieczuleniu ogólnym. Protokół anestezjologa i znieczulenia jest taki sam dla wszystkich pacjentów.

Wszystkie obrazy uzyskano za pomocą skanera MR 1,5-T (Avanto, Siemens, Erlangen, Niemcy) przy użyciu 12-elementowej cewki fazowanej do odbioru sygnału i cewki ciała do transmisji sygnału. Wektorowy system EKG jest używany do bramkowania serca.

Objętości lewej komory (LV) są mierzone od ciągłego, krótkiego osiowego obrazu wolnej precesji w stanie ustalonym, obejmującego obie komory (7-13 warstw, w zależności od wielkości dziecka). Każdy wycinek jest uzyskiwany podczas pojedynczego wstrzymania oddechu na 10 do 15 sekund, jak opisano wcześniej. Całe przetwarzanie obrazu odbywa się za pomocą wewnętrznych wtyczek do oprogramowania Open Source Osirix DICOM (obrazowanie cyfrowe i komunikacja w medycynie). Objętość końcoworozkurczowa lewej komory (EDV) i końcowoskurczowa objętość (ESV) są mierzone przez ręczną segmentację brzegów wsierdzia w danych w osi krótkiej. Dokładna segmentacja przekrojów podstawnych w połączeniu z projekcjami 4-jamowymi i projekcjami w osi długiej LV jest wykonywana w celu przezwyciężenia problemów z określeniem zastawki mitralnej. Objętość wyrzutowa komór (SV) była różnicą między EDV i ESV, a frakcja wyrzutowa komór (%) wynosiła (SV/EDV) × 100.

Dla każdego z drugorzędowych punktów końcowych, EDV, ESV i EF, dokonuje się porównań między zabiegami na podstawie zamiaru leczenia. Analiza krzyżowa pomiarów po leczeniu jest przeprowadzana przy użyciu modelu analizy wariancji, biorąc pod uwagę sekwencję, okres i efekty leczenia. Najpierw badany jest efekt przeniesienia, a tam, gdzie nie ma dowodów na znaczący wpływ, badany jest efekt leczenia. Następnie dopasowano model uogólnionego równania szacowania (GEE), który umożliwił dostosowanie do miar podstawowych.

Tam, gdzie rozkład danych był wyraźnie nienormalny, badacze stosują transformację logarytmiczną. Stata jest używana do wszystkich analiz statystycznych, a wszystkie testy były dwustronne. Wartość P < 0,05 uznano za istotną.