Испытание аутологичных стволовых клеток, полученных из костного мозга, у детей с сердечной недостаточностью

Это пилотное исследование имеет рандомизированный перекрестный плацебо-контролируемый дизайн. Заявление о сводных стандартах отчетности об испытаниях (CONSORT) использовалось для руководства при разработке протокола. Этическое одобрение этого проекта было получено в апреле 2008 года.

Была составлена ​​блок-схема CONSORT и разработан план перекрестного исследования. Хотя основной конечной точкой исследования были безопасность и осуществимость, исследователь стремился рассматривать функциональный результат как вторичную конечную точку. Статистический обзор доступной литературы показал, что изменение фракции выброса (ФВ) на 3%, измеренное с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ), будет представлять собой значимое изменение, и рассчитанных 10 пациентов будет достаточно, чтобы обнаружить это среднее изменение ФВ, при условии, что стандартное отклонение равно разница в 3% при мощности 80% и значимости 5%. Для всех расчетов предполагалось, что распределение различий было Нормальным. Расчет размера выборки для перекрестного исследования требовал определения минимальной обнаруживаемой разницы.

К участию в исследовании будут приглашены дети в возрасте от 1 года до 16 лет на момент рассмотрения, либо посещающие клинику сердечной недостаточности в больнице Грейт-Ормонд-Стрит (GOSH), либо направленные для госпитализации и лечения сердечной недостаточности в GOSH. Нижний возрастной предел был выбран таким образом, чтобы катетеризацию коронарных артерий можно было выполнить с учетом размера пациента.

При наборе у всех больных выявлено нарушение систолической функции, определяемое по сниженной фракции укорочения на эхокардиограмме (более чем на 2 SD ниже нормы). Функциональный статус включенных в исследование пациентов соответствовал 2-4 классу по классификации NYHA или Росса.

Критериями исключения были необходимость высокой зависимости или интенсивной терапии и врожденный порок сердца, вирусная инфекция, которая исключала бы использование больничных лабораторий клеточной терапии, активное злокачественное новообразование и нестабильная лекарственная терапия сердца.

Потенциальные пациенты будут идентифицированы из истории болезни, и с ними и их семьями свяжутся либо по телефону, либо после осмотра клиники, чтобы оценить их заинтересованность в участии. Всем пациентам, которые проявили интерес к участию в исследовании, будет предоставлена ​​письменная информация, соответствующая их возрасту и языку; а также указаны контактные телефоны для предоставления дополнительной информации в случае необходимости. Каждой семье будет предоставлена ​​возможность обсудить исследование с исследовательской группой до того, как будет получено согласие на включение.

Протокол:

Для этого исследования будут набраны десять пациентов, отвечающих критериям приемлемости. Каждого пациента рандомизируют при включении в исследование, чтобы определить, будут ли они получать стволовые клетки в первом или втором периоде протокола. Рандомизацию проводили с использованием компьютерной таблицы случайных чисел Graph pad.

После набора и рандомизации пациенты планируют свой индивидуальный график госпитализации. Те пациенты, которые должны получить стволовые клетки при первом поступлении в исследование, проходят обследование в течение 28 дней, предшествующих этой дате. В рамках этого обзора будет проведен скрининг на наличие инфекции в соответствии с протоколом лаборатории клеточной терапии нашей больницы (включая ВИЧ и гепатиты B и C) после получения полного письменного согласия.

В день процедуры пациент будет госпитализирован в кардиологический дневной стационар для исходного наблюдения и клинической оценки. Процедура исследования будет проводиться в зале МРТ сердца под общим наркозом. Образцы крови будут взяты во время анестезии для рутинных исследований (общий анализ крови, мочевина, электролиты, функция печени и NTproBNP).

У пациентов, получающих интракоронарные стволовые клетки при этой госпитализации, сразу после индукции анестезии в асептических условиях аспирируют 20 мл костного мозга из заднего гребня подвздошной кости.

Техника аспирации костного мозга:

Пациенты, получающие антикоагулянтную терапию, выделяются перед всеми процедурами и госпитализациями, а оптимальное управление коагуляцией осуществляется до, во время и после аспирации костного мозга. Вся обработка костного мозга осуществляется в центре обработки клеточной терапии больницы Грейт-Ормонд-Стрит.

После индукции анестезии и обеспечения стабильной проходимости дыхательных путей пациента укладывают так, чтобы сделать возможной аспирацию костного мозга. На протяжении всей процедуры соблюдаются полные асептические условия. Объем 20 мл костного мозга аспирируется из места прокола одной иглой с помощью шприцев с гепарином на 10 мл, прикрепленных к игле для костного мозга после удаления центрального троакара. Аспирированный костный мозг переносят в стерильные гепаринизированные универсальные флаконы для образцов. Сразу после аспирации образец костного мозга доставляют в лабораторию клеточной терапии для выделения мононуклеаров с использованием стандартных методик градиентного центрифугирования.

Протокол разделения мононуклеарных клеток занимает примерно 90 минут. Образец костного мозга обрабатывается, чтобы получить 1 мл для внутрикоронарной инъекции и 1 мл для криогенного замораживания для дальнейшего фенотипического анализа в более поздние сроки. Небольшую аликвоту суспензии стволовых клеток анализируют для получения общего количества мононуклеарных клеток на миллилитр. Этот подсчет клеток представляет собой общее количество мононуклеарных клеток, введенных посредством внутрикоронарной катетеризации. Кроме того, также оценивали жизнеспособность клеток.

В ожидании подготовленных стволовых клеток выполняется МРТ сердца с использованием протокола задержки дыхания для получения изображения. После МРТ пациента переводят с помощью механизированного выдвижного стола обратно в кабинет ангиографии.

По возвращении в кабинет ангиографии пациент находится под общей анестезией до тех пор, пока лаборатория стволовых клеток не уведомит о том, что обработка стволовых клеток близится к завершению. После контакта с лабораторией стволовых клеток артериальная оболочка помещается в бедренную артерию исследуемого пациента и продвигается до тех пор, пока ее конец не окажется в левой главной коронарной артерии. Наблюдалась частичная окклюзия коронарной артерии, о чем свидетельствуют изменения сегмента ST, и во время таких процедур обычно отслеживают затухание кривой давления. Объем 1 мл медленно вводят через катетер коронарной артерии в левую главную коронарную артерию с последующим промыванием 1 мл 0,9% солевого раствора в течение 2 минут.

После интракоронарной инъекции суспензии стволовых клеток сердечный катетер удаляют и достигается гемостаз в месте проникновения через кожу. Затем пациента будят и приводят в норму стандартным образом.

Пациентов госпитализируют в кардиологическое отделение на ночь с рутинным мониторингом места катетеризации артерий и места аспирации костного мозга; Наблюдения за кардиологической помощью продолжаются повсюду. Пациентов выписывают на следующий день и выборочно осматривают в амбулаторной клинике через три месяца после процедуры или рекомендуют связаться с научным сотрудником раньше, если возникнут какие-либо проблемы.

Перекрестные вмешательства происходят через шесть месяцев, когда группа стволовых клеток получает плацебо посредством катетеризации сердца (для группы плацебо не требуется забора костного мозга) во второй раз. Будут организованы те же прием, мониторинг и последующее наблюдение, что и на этапе исследования стволовых клеток. Плацебо, используемое для интракоронарной инъекции, представляет собой 1 мл 0,9% физиологического раствора, что соответствует раствору плацебо, используемому в исследованиях на взрослых. За 1 мл плацебо следует промывание 1 мл 0,9% солевого раствора для корреляции с группой исследования стволовых клеток. Промежуточный клинический осмотр снова назначается через три месяца после процедуры, а последующая МРТ сердца — через шесть месяцев. Шкала времени была выбрана после обзора доступной литературы для взрослых, которая показала, что воздействие на левый желудочек обычно наблюдается в течение 6 месяцев.

Те пациенты, которым случайным образом распределяли плацебо на первом этапе исследования, переходили на получение стволовых клеток на втором этапе. Промежуточные и окончательные мероприятия по последующему наблюдению одинаковы для групп, получавших стволовые клетки и плацебо.

Анестезия была стандартизирована для всех пациентов, и для всех процедур использовался один и тот же анестезиолог. Подготовка костного мозга также была стандартизирована и выполнялась одним и тем же ученым в каждом случае. Ввод компьютерных данных будет дважды проверен. Идентификаторы пациентов удаляются из анонимных изображений для последующего слепого анализа; таким образом выполняется объективный анализ изображения. Один исследователь, использующий программное обеспечение Osirix, выполняет автономный анализ данных. В качестве второй проверки этих данных результаты исследователя оцениваются вторым анализатором, опять же без учета идентификаторов пациентов. Ключ к ослеплению данных МРТ разрабатывается, применяется и надежно хранится врачом, не участвующим в исследовании. Индексированные значения корректируют данные по возрасту, полу, росту и весу и позволяют проводить точные сравнения между сериями исследований одного и того же человека и между разными людьми.

Первичные показатели результата:

Первичными критериями исхода были отсутствие смерти и трансплантации или любых осложнений, которые можно было бы считать связанными с инъекцией костного мозга или анестезией (инфекция/злокачественное новообразование/анафилаксия/почечная недостаточность). Будет создан комитет по мониторингу безопасности, в который войдут кардиолог из больницы Грейт-Ормонд-стрит, не участвовавший в исследовании, внешний кардиолог и непрофессиональный представитель. О любых неблагоприятных событиях будет сообщено комитету, который был уполномочен остановить испытание в любое время, если возникнут опасения.

Вторичные показатели результатов:

Фракция выброса, объемы и масса левого желудочка получаются из МРТ сердца. Кровь берут на NT proBNP. Кроме того, функциональное состояние оценивается по классификации Нью-Йоркской кардиологической ассоциации или по классификации Росса у детей младшего возраста.

Каждому пациенту делают МРТ сердца под общим наркозом. Анестезиолог и протокол анестезии одинаковы для всех пациентов.

Все изображения получены с помощью 1,5-Тл МР-сканера (Avanto, Siemens, Эрланген, Германия) с использованием 12-элементной катушки с фазированной решеткой для приема сигнала и катушки для тела для передачи сигнала. Векторная система ЭКГ используется для кардиологического стробирования.

Объемы левого желудочка (ЛЖ) измеряются по непрерывной короткой оси стационарного режима свободной прецессии, охватывающей оба желудочка (7-13 срезов, в зависимости от размера ребенка). Каждый срез создается за одну 10–15-секундную задержку дыхания, как описано выше. Вся обработка изображений выполняется с использованием внутренних подключаемых модулей для программного обеспечения Osirix DICOM с открытым исходным кодом (цифровая визуализация и связь в медицине). Конечный диастолический объем ЛЖ (КДО) и конечно-систолический объем (КСО) измеряют путем ручной сегментации эндокардиальных границ в данных по короткой оси. Тщательная сегментация базальных срезов в сочетании с 4-камерной проекцией и проекциями по длинной оси ЛЖ выполняется для преодоления проблем с очерчиванием митрального клапана. Ударный объем желудочков (SV) представлял собой разницу между EDV и ESV, а фракция выброса желудочков (%) составляла (SV/EDV)×100.

Для каждой из вторичных конечных точек, EDV, ESV и EF, сравнения между видами лечения проводятся на основе намерения лечить. Перекрестный анализ показателей после лечения проводится с использованием модели дисперсионного анализа с учетом последовательности, периода и эффектов лечения. Сначала тестируется переносной эффект, а при отсутствии признаков значительного эффекта тестируется лечебный эффект. Последующая модель обобщенного оценочного уравнения (GEE) была адаптирована, что позволило внести поправку на исходные показатели.

Там, где распределение данных было явно ненормальным, исследователи использовали логарифмическое преобразование. Stata используется для всех статистических анализов, и все тесты были двусторонними. Значение P <0,05 считалось значимым.