Ein Versuch mit aus autologem Knochenmark gewonnenen Stammzellen bei pädiatrischer Herzinsuffizienz

Diese Pilotstudie hat ein randomisiertes, placebokontrolliertes Crossover-Design. Die Erklärung der Consolidated Standards of Reporting Trials (CONSORT) wurde verwendet, um die Entwicklung des Protokolls zu leiten. Die ethische Genehmigung wurde für dieses Projekt im April 2008 erhalten.

Ein CONSORT-Flussdiagramm wurde erstellt und ein Projektplan für eine Crossover-Studie entworfen. Obwohl der primäre Endpunkt der Studie Sicherheit und Durchführbarkeit waren, wollte der Prüfarzt das funktionelle Ergebnis als sekundären Endpunkt betrachten. Eine statistische Überprüfung der verfügbaren Literatur ergab, dass eine 3%ige Änderung der Ejektionsfraktion (EF), gemessen durch Magnetresonanztomographie (MRT), eine bedeutende Änderung darstellen würde, und berechnete 10 Patienten würden ausreichen, um diese mittlere Änderung der EF zu erkennen, unter der Annahme einer Standardabweichung von Unterschied von 3 % mit 80 % Power und 5 % Signifikanz. Für alle Berechnungen wurde angenommen, dass die Verteilung der Unterschiede normal war. Die Berechnung eines Stichprobenumfangs für die Crossover-Studie erforderte eine Definition der minimal zu detektierenden Differenz.

Kinder im Alter von 1 bis 16 Jahren bei der Überprüfung, die entweder die Herzinsuffizienzklinik des Great Ormond Street Hospital (GOSH) besuchen oder zur Aufnahme und Behandlung ihrer Herzinsuffizienz an das GOSH überwiesen werden, werden zur Teilnahme an der Studie eingeladen. Die untere Altersgrenze wurde so gewählt, dass eine Koronararterienkatheterisierung unter Berücksichtigung der Größe des Patienten sinnvoll durchgeführt werden kann.

Bei der Rekrutierung haben alle Patienten eine eingeschränkte systolische Funktion, wie durch eine verringerte Verkürzungsfraktion im Echokardiogramm (mehr als 2 SD unter dem Normalwert) festgestellt wird. Der funktionelle Status der rekrutierten Patienten war Klasse 2–4, wie durch die NYHA- oder Ross-Klassifikation definiert.

Ausschlusskriterien waren die Notwendigkeit einer hohen Abhängigkeit oder Intensivpflege und eine angeborene Herzerkrankung, eine Virusinfektion, die die Verwendung von Zelltherapie-Laboreinrichtungen des Krankenhauses ausschließen würde, eine aktive Malignität und eine instabile medikamentöse Herztherapie.

Potenzielle Patienten werden anhand von Fallnotizen identifiziert, und sie und ihre Familien werden entweder telefonisch oder nach einer klinischen Überprüfung kontaktiert, um ihr Interesse an einer Teilnahme zu bewerten. Alle Patienten, die Interesse an einer Teilnahme an der Studie zeigten, erhalten alters- und sprachgerechte schriftliche Informationen; und auch eine Kontakttelefonnummer gegeben, so dass zusätzliche Informationen geliefert werden könnten, falls erforderlich. Jede Familie erhält die Möglichkeit, die Studie mit dem Forschungsteam zu besprechen, bevor die Zustimmung zur Aufnahme eingeholt wurde.

Protokoll:

Zehn Patienten, die die Zulassungskriterien erfüllten, werden für diese Studie rekrutiert. Jeder Patient wird bei Eintritt in die Studie randomisiert, um zu bestimmen, ob er Stammzellen in Phase eins oder Phase zwei des Protokolls erhalten würde. Die Randomisierung wurde unter Verwendung einer computergenerierten Zufallszahlentabelle, Graph Pad, durchgeführt.

Nach der Rekrutierung und Randomisierung haben die Patienten ihren individuellen Aufnahmezeitplan geplant. Diejenigen Patienten, die bei ihrer ersten Studienaufnahme Stammzellen erhalten sollen, werden innerhalb von 28 Tagen vor diesem Datum überprüft. Bei dieser Überprüfung wird nach vollständiger schriftlicher Zustimmung ein Screening auf Infektionen gemäß dem Zelltherapie-Laborprotokoll unseres Krankenhauses (einschließlich HIV und Hepatitis B und C) durchgeführt.

Am Tag des Eingriffs wird der Patient zur Ausgangsbeobachtung und klinischen Beurteilung in die Herztageseinrichtung aufgenommen. Das Studienverfahren wird im Herz-MRT-Saal unter Vollnarkose durchgeführt. Blutproben werden zum Zeitpunkt der Anästhesie für Routineuntersuchungen (großes Blutbild, Harnstoff, Elektrolyte, Leberfunktion und NTproBNP) entnommen.

Den Patienten, die bei dieser Aufnahme intrakoronare Stammzellen erhalten, werden unmittelbar nach Einleitung der Anästhesie unter aseptischen Bedingungen 20 ml Knochenmark aus dem hinteren Beckenkamm entnommen.

Technik der Knochenmarkpunktion:

Die Patienten unter Antikoagulationstherapie werden vor allen Eingriffen und Aufnahmen hervorgehoben und ein optimales Gerinnungsmanagement vor, während und nach der Knochenmarkpunktion durchgeführt. Die gesamte Knochenmarkverarbeitung wird in der Zelltherapie-Verarbeitungsanlage des Great Ormond Street Hospital durchgeführt.

Nach der Narkoseeinleitung und der Sicherung eines stabilen Atemwegs wird der Patient so positioniert, dass eine Knochenmarkaspiration möglich ist. Während des gesamten Verfahrens werden vollständig aseptische Bedingungen eingehalten. Ein Volumen von 20 ml Knochenmark wird aus einer Punktionsstelle mit einer einzelnen Nadel unter Verwendung von heparinisierten 10-ml-Spritzen, die an der Knochenmarksnadel befestigt sind, nach Entfernung des zentralen Trokars aspiriert. Das abgesaugte Knochenmark wird in sterile heparinisierte Universalprobenflaschen überführt. Unmittelbar nach dem Absaugen wird die Knochenmarkprobe zur Abtrennung mononukleärer Zellen unter Verwendung von Standardtechniken der Gradientenzentrifugation in das Zelltherapielabor gebracht.

Das Protokoll zur Trennung mononukleärer Zellen dauert etwa 90 Minuten. Die Knochenmarkprobe wird verarbeitet, um 1 ml für die intrakoronare Injektion bereitzustellen und 1 ml, das für eine weitere phänotypische Analyse zu einem späteren Zeitpunkt kryogen eingefroren wird. Ein kleines Aliquot der Stammzellsuspension wird analysiert, um die Gesamtzahl der mononukleären Zellen pro Milliliter zu erhalten. Diese Zellzahl stellt die Gesamtzahl der mononukleären Zellen dar, die über eine intrakoronare Katheterisierung injiziert wurden. Zusätzlich wurde auch die Zelllebensfähigkeit bewertet.

Während auf die präparierten Stammzellen gewartet wird, wird der kardiale MRT-Scan unter Verwendung eines Atemanhalteprotokolls zur Bildaufnahme durchgeführt. Nach der MRT-Untersuchung wird der Patient mittels des mechanisierten Schiebetisches zurück in die Angiographie-Suite transferiert.

Nach der Rückkehr in die Angiographie-Suite wird der Patient unter Vollnarkose gehalten, bis das Stammzelllabor benachrichtigt, dass die Stammzellverarbeitung kurz vor dem Abschluss steht. Nach Kontakt mit dem Stammzelllabor wird eine arterielle Schleuse in die Femoralarterie des Studienpatienten platziert und vorgeschoben, bis ihre Spitze in der linken Hauptkoronararterie sitzt. Ein partieller Verschluss der Koronararterie wurde beobachtet, wie durch ST-Strecken-Änderungen demonstriert, und die Dämpfung der Druckspur wird routinemäßig während solcher Verfahren überwacht. Das Volumen von 1 ml wird langsam über den Koronararterienkatheter in die linke Hauptkoronararterie injiziert, gefolgt von einer Spülung mit 1 ml 0,9 %iger Kochsalzlösung über einen Zeitraum von 2 Minuten.

Nach der intrakoronaren Injektion der Stammzellsuspension wird der Herzkatheter entfernt und eine Hämostase an der Hauteintrittsstelle erreicht. Der Patient wird dann geweckt und auf übliche Weise wiederhergestellt.

Die Patienten werden über Nacht auf der Herzstation aufgenommen, wobei die Zugangsstelle zur arteriellen Katheterisierung und die Stelle zur Knochenmarkpunktion routinemäßig überwacht werden; kardiologische Beobachtungen werden durchgehend fortgesetzt. Die Patienten werden am nächsten Tag entlassen und wahlweise drei Monate nach dem Eingriff in der Ambulanz untersucht oder aufgefordert, sich bei Bedenken früher an den Research Fellow zu wenden.

Das Cross-over der Interventionen erfolgt nach sechs Monaten, wobei die Stammzellgruppe beim zweiten Mal Placebo über die Herzkatheterisierung erhält (für den Placebo-Arm der Studie ist keine Knochenmarkentnahme erforderlich). Die gleiche Aufnahme, Überwachung und Nachsorge wird wie für die Stammzellphase der Studie arrangiert. Das für die intrakoronare Injektion verwendete Placebo ist 1 ml 0,9 %ige Kochsalzlösung, was mit der in Studien mit Erwachsenen verwendeten Placebo-Lösung übereinstimmt. Auf 1 ml Placebo folgt eine Spülung mit 1 ml 0,9 % Kochsalzlösung zur Korrelation mit dem Stammzellenarm der Studie. Drei Monate nach dem Eingriff wird erneut eine Zwischenuntersuchung in der Klinik und nach sechs Monaten eine kardiale MRT-Untersuchung durchgeführt. Die Zeitskala wurde nach Durchsicht der verfügbaren Erwachsenenliteratur gewählt, die zeigte, dass Wirkungen auf den linken Ventrikel normalerweise innerhalb von 6 Monaten zu sehen waren.

Diese Patienten, denen in Phase eins der Studie nach dem Zufallsprinzip Placebo zugeteilt wurde, wechseln in Phase zwei, um Stammzellen zu erhalten. Zwischen- und endgültige Nachsorgeregelungen sind für die Stammzell- und die Placebogruppe gleich.

Die Anästhesie wurde für alle Patienten standardisiert und derselbe Anästhesist wurde für alle Verfahren eingesetzt. Auch die Knochenmarkpräparation war standardisiert und wurde jeweils von demselben Wissenschaftler durchgeführt. Die Computerdateneingabe wird doppelt überprüft. Patientenidentifikatoren werden aus den anonymen Bildern entfernt, um später eine blinde Analyse zu ermöglichen; Auf diese Weise wird eine unvoreingenommene Bildanalyse durchgeführt. Ein einzelner Forscher, der die Osirix-Software verwendet, führt eine Offline-Analyse der Daten durch. Als zweite Überprüfung dieser Daten werden die Ergebnisse des Forschers wiederum blind für Patientenidentifikatoren von einem zweiten Analysegerät ausgewertet. Der Schlüssel zur Verblindung der MRT-Daten wird von einem Kliniker entwickelt, angewendet und sicher gespeichert, der ansonsten nicht an der Studie beteiligt ist. Indexierte Werte korrigieren die Daten für Alter, Geschlecht, Größe und Gewicht und ermöglichen echte Vergleiche zwischen den Studienreihen derselben Person und zwischen verschiedenen Personen.

Primäre Ergebnismaße:

Die primären Endpunkte waren die Freiheit von Tod und Transplantation oder jeglicher Komplikation, die in Zusammenhang mit einer Knochenmarkinjektion oder Anästhesie stehen könnte (Infektion/Malignität/Anaphylaxie/Nierenverschlechterung). Es wird ein Sicherheitsüberwachungsausschuss eingerichtet, dem ein Kardiologe des Great Ormond Street Hospital, der nicht an der Studie beteiligt ist, ein externer Kardiologe und ein Laienvertreter angehören. Alle unerwünschten Ereignisse werden dem Komitee gemeldet, das befugt war, die Studie jederzeit abzubrechen, wenn Bedenken auftauchten.

Sekundäre Ergebnismaße:

Ejektionsfraktion, linksventrikuläre Volumina und Masse werden aus der Herz-MRT abgeleitet. Für NT proBNP wird Blut abgenommen. Zusätzlich wird der Funktionsstatus durch die Klassifikation der New York Heart Association oder die Ross-Klassifikation bei jüngeren Kindern beurteilt.

Jeder Patient erhält ein Herz-MRT unter Vollnarkose. Das Anästhesie- und Anästhesieprotokoll ist für alle Patienten gleich.

Alle Bilder werden mit einem 1,5-T-MR-Scanner (Avanto, Siemens, Erlangen, Deutschland) unter Verwendung einer Phased-Array-Spule mit 12 Elementen für den Signalempfang und der Körperspule für die Signalübertragung erhalten. Für das Herz-Gating wird ein Vektor-EKG-System verwendet.

Die Volumina des linken Ventrikels (LV) werden aus zusammenhängenden Kurzachsen-Steady-State-Filmen mit freier Präzession gemessen, die beide Ventrikel abdecken (7–13 Schichten, abhängig von der Größe des Kindes). Jede Schicht wird wie zuvor beschrieben in einem einzigen 10- bis 15-sekündigen Atemanhalten erfasst. Die gesamte Bildverarbeitung erfolgt mit hauseigenen Plug-Ins für die Open-Source-Software Osirix DICOM (Digital Imaging and Communications in Medicine). Das enddiastolische LV-Volumen (EDV) und das endsystolische Volumen (ESV) werden durch manuelle Segmentierung der Endokardgrenzen in den Kurzachsendaten gemessen. Eine sorgfältige Segmentierung der Basalschnitte in Verbindung mit 4-Kammer- und LV-Längsachsenansichten wird durchgeführt, um Probleme mit der Abgrenzung der Mitralklappe zu überwinden. Das ventrikuläre Schlagvolumen (SV) war die Differenz zwischen EDV und ESV, und die ventrikuläre Ejektionsfraktion (%) war (SV/EDV) × 100.

Für jeden der sekundären Endpunkte, EDV, ESV und EF, werden Vergleiche zwischen den Behandlungen auf der Grundlage der Behandlungsabsicht durchgeführt. Eine Crossover-Analyse der Nachbehandlungsmaßnahmen wird unter Verwendung eines Analyse-Varianz-Modells unter Berücksichtigung von Sequenz, Zeitraum und Behandlungseffekten durchgeführt. Der Carry-over-Effekt wird zuerst getestet, und wenn es keine Hinweise auf einen signifikanten Effekt gibt, wird der Behandlungseffekt getestet. Ein nachfolgendes GEE-Modell (Generalized Estimating Equation) wurde angepasst, das eine Anpassung für Baseline-Maßnahmen ermöglichte.

Wo die Verteilung der Daten eindeutig nicht normal war, verwenden die Ermittler eine logarithmische Transformation. Stata wird für alle statistischen Analysen verwendet und alle Tests waren zweiseitig. Ein P-Wert < 0,05 wurde als signifikant angesehen.