Um teste de células-tronco derivadas da medula óssea autólogas na insuficiência cardíaca pediátrica

Este estudo piloto é de design randomizado, cruzado e controlado por placebo. A declaração Consolidated Standards of Reporting Trials (CONSORT) foi usada para orientar o desenvolvimento do protocolo. A aprovação ética foi obtida para este projeto em abril de 2008.

Um diagrama de fluxo CONSORT foi produzido e um plano de projeto para um estudo cruzado desenhado. Embora o ponto final primário do estudo fosse a segurança e a viabilidade, o investigador teve como objetivo observar o resultado funcional como um ponto final secundário. A revisão estatística da literatura disponível indicou que uma alteração de 3% na fração de ejeção (FE) medida pela ressonância magnética (MRI) representaria uma alteração significativa e o cálculo de 10 pacientes seria suficiente para detectar essa alteração média na FE, assumindo um DP de diferença de 3% com poder de 80% e significância de 5%. Para todos os cálculos foi assumido que a distribuição das diferenças era Normal. O cálculo de um tamanho de amostra para o estudo cruzado exigiu a definição da diferença mínima a ser detectada.

Crianças com idade entre 1 ano e 16 anos na revisão, atendidas na Clínica de Insuficiência Cardíaca no Great Ormond Street Hospital (GOSH) ou encaminhadas para admissão e tratamento de insuficiência cardíaca no GOSH serão convidadas a participar do estudo. O limite inferior de idade foi selecionado para permitir que a cateterização da artéria coronária seja realizada de forma viável, levando em consideração o tamanho do paciente.

No recrutamento, todos os pacientes têm função sistólica prejudicada, conforme determinado pela redução da fração de encurtamento no ecocardiograma (mais de 2 DP abaixo do normal). O estado funcional dos pacientes recrutados era de classe 2-4 conforme definido pela classificação NYHA ou Ross.

Os critérios de exclusão foram a necessidade de alta dependência ou cuidados intensivos e cardiopatia congênita, infecção viral que impossibilitasse o uso das instalações hospitalares do Laboratório de Terapia Celular, malignidade ativa e terapia medicamentosa cardíaca instável.

Os pacientes em potencial serão identificados a partir das anotações do caso, e eles e suas famílias serão abordados por telefone ou após revisão clínica para avaliar seu interesse em participar. Quaisquer pacientes que pareçam interessados ​​em participar do estudo receberão informações escritas apropriadas sobre idade e idioma; e também fornecido um número de telefone de contato para que informações adicionais possam ser fornecidas, se necessário. Cada família terá a oportunidade de discutir o estudo com a equipe de pesquisa antes de obter o consentimento para inclusão.

Protocolo:

Dez pacientes que preencheram os critérios de elegibilidade serão recrutados para este estudo. Cada paciente é randomizado ao entrar no estudo para determinar se receberá células-tronco no Período Um ou no Período Dois do protocolo. A randomização foi realizada usando uma tabela de números aleatórios gerada por computador, Graph pad.

Após o recrutamento e a randomização, os pacientes têm seu cronograma de admissão individual planejado. Os pacientes que receberão células-tronco em sua primeira admissão no estudo são revisados ​​nos 28 dias anteriores a essa data. Nesta revisão, a triagem para infecção, de acordo com o protocolo do Laboratório de Terapia Celular do nosso hospital (incluindo HIV e hepatite B e C), será realizada após o consentimento completo por escrito.

No dia do procedimento, o paciente será internado na creche cardíaca para observações iniciais e avaliação clínica. O procedimento do estudo será realizado na sala de ressonância magnética cardíaca sob anestesia geral. Amostras de sangue serão coletadas no momento da anestesia para investigação de rotina (hemograma completo, ureia, eletrólitos, função hepática e NTproBNP).

Os pacientes que receberam células-tronco intracoronárias nesta admissão têm 20 mL de medula óssea aspirados da crista ilíaca posterior sob condições assépticas imediatamente após a indução da anestesia.

Técnica de aspiração da medula óssea:

Os pacientes em terapia de anticoagulação são destacados antes de todos os procedimentos e internações, e o gerenciamento ideal da coagulação é implementado antes, durante e após a aspiração da medula óssea. Todo o processamento da medula óssea é realizado nas instalações de processamento de terapia celular do Great Ormond Street Hospital.

Após a indução anestésica e a garantia de uma via aérea estável, o paciente é posicionado para permitir a aspiração da medula óssea. Condições assépticas completas são observadas durante todo o procedimento. Um volume de 20 mL de medula óssea é aspirado de um único local de punção de agulha usando seringas heparinizadas de 10 mL conectadas à agulha de medula óssea após a remoção do trocater central. A medula óssea aspirada é transferida para frascos de espécimes universais heparinizados estéreis. Imediatamente após a aspiração, a amostra de medula óssea é levada ao laboratório de terapia celular para separação de células mononucleares usando técnicas padrão de centrifugação de gradiente.

O protocolo de separação de células mononucleares leva aproximadamente 90 minutos para ser concluído. A amostra de medula óssea é processada para fornecer 1 mL para injeção intracoronária e 1 mL para ser congelado criogenicamente para posterior análise fenotípica em uma data posterior. Uma pequena alíquota de suspensão de células-tronco é analisada para obter contagens totais de células mononucleares por mililitros. Esta contagem de células representa o número total de células mononucleares injetadas por meio de cateterismo intracoronário. Além disso, a viabilidade celular também foi avaliada.

Enquanto espera pelas células-tronco preparadas, a ressonância magnética cardíaca é realizada usando um protocolo de apneia para aquisição de imagem. Após a ressonância magnética, o paciente é transferido por meio da mesa deslizante mecanizada de volta para a sala de angiografia.

Ao retornar à sala de angiografia, o paciente é mantido sob anestesia geral até que o laboratório de células-tronco avise que o processamento das células-tronco está quase concluído. Após o contato com o laboratório de células-tronco, uma bainha arterial é colocada na artéria femoral do paciente do estudo e avançada até que sua ponta esteja localizada no tronco da artéria coronária esquerda. Observou-se oclusão parcial da artéria coronária, demonstrada pelas alterações do segmento ST, e o amortecimento do traçado pressórico é rotineiramente monitorado durante tais procedimentos. O volume de 1mL é injetado lentamente através do cateter da artéria coronária no tronco da artéria coronária esquerda, seguido de 1mL de solução salina a 0,9% durante um período de 2 minutos.

Após a injeção intracoronária da suspensão de células-tronco, o cateter cardíaco é removido e a hemostasia no local de entrada da pele é alcançada. O paciente é então acordado e recuperado de maneira padrão.

Os pacientes são internados na enfermaria cardíaca durante a noite com monitoramento de rotina do local de acesso do cateterismo arterial e do local de aspiração da medula óssea; observações de cuidados cardíacos são continuadas por toda parte. Os pacientes recebem alta no dia seguinte e são revisados ​​eletivamente no ambulatório três meses após o procedimento ou aconselhados a entrar em contato com o pesquisador mais cedo se houver alguma dúvida.

O cruzamento de intervenções ocorre em seis meses com o grupo de células-tronco recebendo placebo por meio de cateterismo cardíaco (não é necessária colheita de medula óssea para o braço de placebo do estudo) na segunda ocasião. A mesma admissão, monitoramento e acompanhamento serão organizados como para a etapa de células-tronco do estudo. O placebo utilizado para a injeção intracoronária utilizada é 1mL de soro fisiológico 0,9%, compatível com a solução placebo utilizada em estudos com adultos. O 1mL de placebo é seguido por 1mL de solução salina a 0,9% para correlação com o braço de células-tronco do estudo. Uma revisão clínica interina é novamente marcada três meses após o procedimento e uma ressonância magnética cardíaca de acompanhamento seis meses depois. A escala de tempo foi escolhida após a revisão da literatura disponível para adultos, que mostrou que os efeitos no ventrículo esquerdo geralmente eram observados em 6 meses.

Esses pacientes alocados aleatoriamente em placebo no estágio um do estudo cruzam para receber células-tronco no estágio dois. Os arranjos provisórios e finais de acompanhamento são os mesmos para os grupos de células-tronco e placebo.

A anestesia foi padronizada para todos os pacientes e o mesmo anestesista utilizado para todos os procedimentos. A preparação da medula óssea também foi padronizada e realizada pelo mesmo cientista em cada caso. A entrada de dados do computador será verificada duas vezes. Os identificadores dos pacientes são removidos das imagens anônimas para permitir análises cegas posteriormente; desta forma, a análise de imagem imparcial é realizada. Um único pesquisador usando o software Osirix realiza a análise off-line dos dados. Como uma segunda verificação desses dados, os resultados do pesquisador são avaliados, novamente cegos para os identificadores do paciente, por um segundo analisador. A chave para ocultar os dados de ressonância magnética é concebida, aplicada e armazenada de forma segura por um clínico não envolvido no estudo. Os valores indexados corrigem os dados de idade, sexo, altura e peso e permitem comparações verdadeiras entre as séries de estudos do mesmo indivíduo e entre indivíduos diferentes.

Medidas de resultados primários:

As medidas de desfecho primário foram ausência de morte e transplante ou qualquer complicação que pudesse ser considerada relacionada à injeção de medula óssea ou anestesia (infecção/malignidade/anafilaxia/deterioração renal). Será estabelecido um comitê de monitoramento de segurança, incluindo um cardiologista do Great Ormond Street Hospital não envolvido no estudo, um cardiologista externo e um representante leigo. Quaisquer eventos adversos serão relatados ao comitê que foi autorizado a interromper o estudo a qualquer momento se surgirem preocupações.

Medidas de resultados secundários:

A fração de ejeção, os volumes e a massa do ventrículo esquerdo são derivados da ressonância magnética cardíaca. O sangue é coletado para NT proBNP. Além disso, o estado funcional é avaliado pela classificação da New York Heart Association ou pela classificação de Ross em crianças mais novas.

Cada paciente tem uma ressonância magnética cardíaca sob anestesia geral. O anestesista e o protocolo de anestesia são os mesmos para todos os pacientes.

Todas as imagens são obtidas com um scanner de RM de 1,5 T (Avanto, Siemens, Erlangen, Alemanha) usando uma bobina Phased Array de 12 elementos para recepção de sinal e a bobina de corpo para transmissão de sinal. Um sistema de ECG vetorial é usado para gating cardíaco.

Os volumes do ventrículo esquerdo (LV) são medidos a partir de cine de precessão livre de estado estacionário de eixo curto contíguo cobrindo ambos os ventrículos (7-13 cortes, dependendo do tamanho da criança). Cada fatia é adquirida em uma única apneia de 10 a 15 segundos, conforme descrito anteriormente. Todo o processamento de imagens é realizado usando plug-ins internos para o software Osirix DICOM (imagens digitais e comunicações em medicina) de código aberto. O volume diastólico final do VE (EDV) e o volume sistólico final (ESV) são medidos por segmentação manual das bordas endocárdicas nos dados do eixo curto. A segmentação cuidadosa dos cortes basais em conjunto com as visualizações de 4 câmaras e eixo longo do VE é realizada para superar problemas com o delineamento da válvula mitral. O volume sistólico ventricular (SV) foi a diferença entre o EDV e o ESV, e a fração de ejeção ventricular (%) foi (SV/EDV)×100.

Para cada um dos pontos finais secundários, EDV, ESV e EF, as comparações entre os tratamentos são feitas com base na intenção de tratar. Uma análise cruzada em medidas pós-tratamento é realizada usando um modelo de análise de variância, considerando os efeitos de sequência, período e tratamento. O efeito residual é testado primeiro e, quando não há evidência de um efeito significativo, o efeito do tratamento é testado. Um modelo subsequente de equação de estimativa generalizada (GEE) foi ajustado, o que permitiu um ajuste para medidas de linha de base.

Onde a distribuição dos dados foi claramente não-normal, os investigadores usam uma transformação logarítmica. O Stata é usado para todas as análises estatísticas e todos os testes foram bilaterais. Um valor de P < 0,05 foi considerado significativo.