Autologisten luuytimestä peräisin olevien kantasolujen kokeilu lasten sydämen vajaatoiminnassa

Tämä pilottitutkimus on satunnaistettu, ristikkäinen, lumekontrolloitu malli. Protokollan kehittämisen ohjauksessa käytettiin Consolidated Standards of Reporting Trials (CONSORT) -lausuntoa. Tälle hankkeelle saatiin eettinen hyväksyntä huhtikuussa 2008.

Valmistettiin CONSORT-vuokaavio ja laadittiin projektisuunnitelma crossover-tutkimukselle. Vaikka tutkimuksen ensisijainen päätepiste oli turvallisuus ja toteutettavuus, tutkija pyrki tarkastelemaan toiminnallista lopputulosta toissijaisena päätetapahtumana. Tilastollinen katsaus saatavilla olevaan kirjallisuuteen osoitti, että 3 %:n muutos ejektiofraktiossa (EF) mitattuna magneettikuvauksella (MRI) olisi merkittävä muutos, ja laskettu 10 potilasta riittäisi havaitsemaan tämä keskimääräinen muutos EF:ssä, olettaen, että SD 3 % ero 80 % teholla ja 5 % merkitsevyys. Kaikissa laskelmissa oletettiin, että erojen jakautuminen oli Normaali. Crossover-tutkimuksen otoskoon laskeminen edellytti havaittavan vähimmäiseron määrittelyä.

Tutkimukseen osallistuvat 1–16-vuotiaat lapset, jotka ovat joko Great Ormond Streetin sairaalan (GOSH) sydämen vajaatoiminnan klinikalla tai jotka on lähetetty GOSH:n vastaanotolle ja sydämen vajaatoiminnan hoitoon. Alaikäraja valittiin siten, että sepelvaltimon katetrointi olisi mahdollista suorittaa potilaan koko huomioon ottaen.

Kaikilla potilailla on rekrytoinnin yhteydessä heikentynyt systolinen toiminta, mikä on määritetty sydämen kaikututkimuksen pienentyneen lyhennetyn fraktion perusteella (yli 2 SD alle normaalin). Rekrytoitujen potilaiden toimintatila oli luokkaa 2-4 NYHA- tai Ross-luokituksen mukaan.

Poissulkemiskriteereinä olivat suuren riippuvuuden tai tehohoidon tarve ja synnynnäinen sydänsairaus, virusinfektio, joka estäisi sairaalan soluterapialaboratorion tilojen käytön, aktiivinen pahanlaatuisuus ja epästabiili sydämen lääkehoito.

Potentiaaliset potilaat tunnistetaan tapausmuistiinpanoista, ja heihin ja heidän perheisiinsä tullaan joko puhelimitse tai klinikkatarkastuksen jälkeen arvioimaan heidän kiinnostuksensa osallistua. Kaikille potilaille, jotka näyttivät olevan kiinnostuneita osallistumaan tutkimukseen, annetaan ikään ja kieleen sopiva kirjallinen tieto; ja myös puhelinnumero, josta voidaan tarvittaessa antaa lisätietoja. Jokaiselle perheelle annetaan mahdollisuus keskustella tutkimuksesta tutkimusryhmän kanssa ennen suostumuksen saamista mukaan ottamiseen.

Protokolla:

Tähän tutkimukseen rekrytoidaan kymmenen kelpoisuuskriteerit täyttävää potilasta. Jokainen potilas satunnaistetaan tutkimukseen tullessa sen määrittämiseksi, saisivatko he kantasoluja protokollan ensimmäisen vai toisen jakson aikana. Satunnaistaminen suoritettiin käyttämällä tietokoneella luotua satunnaislukutaulukkoa Graph pad.

Rekrytoinnin ja satunnaistamisen jälkeen potilaille suunnitellaan yksilöllinen vastaanottoaikataulu. Potilaat, jotka saavat kantasoluja ensimmäisen tutkimuksensa yhteydessä, tarkistetaan tätä päivää edeltävien 28 päivän sisällä. Tässä tarkastelussa suoritetaan sairaalan soluterapialaboratoriomme protokollan mukainen infektioseulonta (mukaan lukien HIV ja hepatiitti B ja C) täyden kirjallisen suostumuksen jälkeen.

Toimenpidepäivänä potilas viedään sydänpäivähoitoon lähtötilanteen havainnointiin ja kliiniseen arviointiin. Tutkimustoimenpiteet suoritetaan sydämen MRI-salissa yleisanestesiassa. Verinäytteet otetaan anestesian yhteydessä rutiinitutkimusta varten (täysi verenkuva, urea, elektrolyytit, maksan toiminta ja NTproBNP).

Potilailla, jotka saavat intrakoronaarisia kantasoluja tämän vastaanoton yhteydessä, aspiroidaan 20 ml luuydintä suoliluun takaosasta aseptisissa olosuhteissa välittömästi anestesian induktion jälkeen.

Luuytimen aspiraatiotekniikka:

Antikoagulaatiohoitoa saavat potilaat korostetaan ennen kaikkia toimenpiteitä ja vastaanottoa, ja optimaalinen hyytymisen hallinta toteutetaan ennen luuytimen aspiraatiota, sen aikana ja sen jälkeen. Kaikki luuytimen prosessointi suoritetaan Great Ormond Streetin sairaalan soluterapiakäsittelylaitoksessa.

Anestesia-induktion ja vakaiden hengitysteiden varmistamisen jälkeen potilas asetetaan siten, että se mahdollistaa luuytimen aspiraation. Täysi aseptisia olosuhteita noudatetaan koko toimenpiteen ajan. 20 ml:n tilavuus luuydintä aspiroidaan yhdestä neulan pistokohdasta käyttämällä heparinisoituja 10 ml:n ruiskuja, jotka on kiinnitetty luuytimen neulaan keskustroaarin poistamisen jälkeen. Aspiroitu luuydin siirretään steriileihin heparinisoituihin yleisnäytepulloihin. Välittömästi aspiraation jälkeen luuydinnäyte viedään soluterapialaboratorioon mononukleaaristen solujen erottamista varten käyttäen standardigradienttisentrifugointitekniikoita.

Yksitumaisten solujen erotusprotokollan suorittaminen kestää noin 90 minuuttia. Luuydinnäyte käsitellään niin, että saadaan 1 ml sepelvaltimonsisäistä injektiota varten ja 1 ml pakastetaan kryogeenisesti myöhempää fenotyyppianalyysiä varten. Pieni osa kantasolususpensiota analysoidaan mononukleaaristen solujen kokonaismäärän saamiseksi millilitraa kohti. Tämä solumäärä edustaa sepelvaltimonsisäisen katetroinnilla injektoitujen mononukleaaristen solujen kokonaismäärää. Lisäksi solujen elinkelpoisuus arvioitiin.

Valmisteltuja kantasoluja odotellessa sydämen MRI-skannaus suoritetaan kuvanottoa varten hengityspidätysprotokollalla. Magneettikuvauksen jälkeen potilas siirretään mekanisoidun liukupöydän avulla takaisin angiografiayksikköön.

Palattuaan angiografiaosastolle potilasta pidetään yleisanestesiassa, kunnes kantasolulaboratorio ilmoittaa, että kantasolujen käsittely on päättymässä. Kantasolulaboratorion kanssa kosketuksen jälkeen valtimovaippa asetetaan tutkimuspotilaan reisivaltimoon ja viedään eteenpäin, kunnes sen kärki asettuu vasempaan pääsepelvaltimoon. Sepelvaltimon osittainen tukos havaittiin ST-segmentin muutoksilla, ja painejäljen vaimennusta seurataan rutiininomaisesti tällaisten toimenpiteiden aikana. 1 ml:n tilavuus ruiskutetaan hitaasti sepelvaltimon katetrin kautta vasempaan päävaltimoon, minkä jälkeen huuhdellaan 1 ml 0,9 % suolaliuosta 2 minuutin aikana.

Kantasolususpension intrakoronaarisen injektion jälkeen sydänkatetri poistetaan ja hemostaasi saavutetaan ihon sisääntulokohdassa. Sitten potilas herätetään ja toipuu normaalisti.

Potilaat viedään sydänosastolle yön yli valtimokatetrointikohdan ja luuytimen aspiraatiokohdan rutiininomaisella seurannalla; sydänhoidon havaintoja jatketaan koko ajan. Potilaat kotiutetaan seuraavana päivänä ja tarkastetaan valinnaisesti poliklinikalla kolme kuukautta toimenpiteen jälkeen tai heitä kehotetaan ottamaan yhteyttä tutkijaan aikaisemmin, jos on huolenaiheita.

Interventioiden jako tapahtuu kuuden kuukauden kuluttua kantasoluryhmälle, joka saa lumelääkettä sydämen katetroinnilla (tutkimuksen lumelääkehaarassa ei vaadita luuytimen keräämistä) toisella kerralla. Pääsy, seuranta ja seuranta järjestetään samat kuin tutkimuksen kantasoluvaiheessa. Intrakoronaariseen injektioon käytetty lumelääke on 1 ml 0,9 % suolaliuosta, mikä on yhdenmukainen aikuistutkimuksissa käytetyn lumelääkeliuoksen kanssa. 1 ml lumelääkettä seuraa 1 ml 0,9-prosenttista suolaliuosta huuhtelemalla korrelaatiota tutkimuksen kantasoluhaaraan. Väliaikainen klinikkatarkastus järjestetään jälleen kolmen kuukauden kuluttua toimenpiteestä ja seuranta sydämen MRI-skannaus kuuden kuukauden kuluttua. Aika-asteikko valittiin saatavilla olevan aikuisten kirjallisuuden tarkastelun jälkeen, joka osoitti, että vaikutukset vasempaan kammioon havaittiin yleensä 6 kuukauden kuluessa.

Ne potilaat, jotka saivat satunnaisesti lumelääkettä tutkimuksen ensimmäisessä vaiheessa, siirtyvät vastaanottamaan kantasoluja toisessa vaiheessa. Väliaikaiset ja lopulliset seurantajärjestelyt ovat samat kantasolu- ja lumeryhmille.

Anestesia oli standardoitu kaikille potilaille ja sama anestesialääkäri käytettiin kaikissa toimenpiteissä. Luuytimen valmistelu oli myös standardoitu ja sama tutkija suoritti kussakin tapauksessa. Tietokoneen tietojen syöttö tarkistetaan uudelleen. Potilastunnisteet poistetaan anonyymeistä kuvista sokean analyysin mahdollistamiseksi myöhemmin; tällä tavalla suoritetaan puolueeton kuva-analyysi. Yksi Osirix-ohjelmistoa käyttävä tutkija suorittaa tietojen off-line-analyysin. Toisena näiden tietojen tarkistuksena tutkijan tulokset arvioidaan toisen analysaattorin toimesta, jälleen sokeasti potilastunnisteille. Avain MRI-tietojen sokeuttamiseen on lääkärin, joka ei muuten osallistu tutkimukseen, suunnittelee, soveltaa ja tallentaa turvallisesti. Indeksoidut arvot korjaavat iän, sukupuolen, pituuden ja painon tiedot ja mahdollistavat oikeiden vertailujen tekemisen saman yksilön tutkimussarjojen ja eri yksilöiden välillä.

Ensisijaiset tulosmittaukset:

Ensisijaisina tulosmittaina olivat vapautuminen kuolemasta ja siirrosta tai kaikista komplikaatioista, joiden voidaan katsoa liittyvän luuytimen injektioon tai anestesiaan (infektio/pahanlaatuisuus/anafylaksia/munuaisten heikkeneminen). Perustetaan turvallisuusseurantakomitea, johon kuuluu kardiologi Great Ormond Streetin sairaalasta, joka ei osallistu tutkimukseen, ulkopuolinen kardiologi ja maallikkoedustaja. Kaikista haittatapahtumista ilmoitetaan komitealle, jolla oli valtuudet keskeyttää tutkimus milloin tahansa, jos huolenaiheita ilmenee.

Toissijaiset tulosmittaukset:

Ejektiofraktio, vasemman kammion tilavuudet ja massa saadaan sydämen MRI:stä. Veri otetaan NT proBNP:tä varten. Lisäksi toiminnallinen tila arvioidaan New York Heart Associationin luokituksen tai nuorempien lasten Ross-luokituksen mukaan.

Jokaiselle potilaalle tehdään sydämen MRI yleisanestesiassa. Anestesialääkäri ja anestesiaprotokolla ovat samat kaikille potilaille.

Kaikki kuvat saadaan 1,5-T MR-skannerilla (Avanto, Siemens, Erlangen, Saksa) käyttäen 12-elementistä vaiheistettua rivikäämiä signaalin vastaanottoon ja runkokäämiä signaalin siirtoon. Vektori-EKG-järjestelmää käytetään sydämen portitukseen.

Vasemman kammion (LV) tilavuudet mitataan vierekkäisestä lyhyen akselin vakaan tilan vapaasta precessiokuvasta, joka kattaa molemmat kammiot (7-13 viipaletta, lapsen koosta riippuen). Jokainen viipale hankitaan yhdellä 10-15 sekunnin hengityksen pidätyksellä, kuten aiemmin on kuvattu. Kaikki kuvankäsittely suoritetaan käyttämällä avoimen lähdekoodin Osirix DICOM (digital imaging and communications in medicine) -ohjelmiston sisäisiä laajennuksia. LV:n loppudiastolinen tilavuus (EDV) ja loppusystolinen tilavuus (ESV) mitataan endokardiaalisten rajojen manuaalisella segmentoinnilla lyhyen akselin tiedoissa. Perusviipaleiden huolellinen segmentointi 4-kammioisten ja LV-pitkäakselin näkymien yhteydessä suoritetaan mitraaliläpän rajaamiseen liittyvien ongelmien ratkaisemiseksi. Kammioiskutilavuus (SV) oli ero EDV:n ja ESV:n välillä, ja kammion ejektiofraktio (%) oli (SV/EDV) × 100.

Kunkin toissijaisen päätepisteen, EDV:n, ESV:n ja EF:n, hoitojen vertailut tehdään hoitoaikeen perusteella. Hoidon jälkeisten toimenpiteiden crossover-analyysi tehdään varianssianalyysin avulla ottaen huomioon järjestys, jakso ja hoidon vaikutukset. Ensin testataan siirtymävaikutus, ja jos merkittävästä vaikutuksesta ei ole näyttöä, testataan hoidon vaikutus. Myöhemmin sovitettiin yleinen estimointiyhtälön (GEE) malli, joka mahdollisti perusmittausten mukautuksen.

Jos tietojen jakauma oli selvästi epänormaali, tutkijat käyttävät logaritmista muunnosa. Tilastoa käytetään kaikkiin tilastollisiin analyyseihin ja kaikki testit olivat kaksipuolisia. P-arvoa < 0,05 pidettiin merkitsevänä.