Alacsony kockázatú MDS-betegek mutációs terhelésének monitorozása szekvenciális perifériás vérminták segítségével

A myelodysplasiás szindrómák (MDS) a klonális hematopoietikus őssejt rosszindulatú daganatok heterogén csoportja. A szomatikus citogenetikai és molekuláris aberrációk, valamint a szubklonális rosszindulatú sejtpopulációk evolúciója felelős az MDS kialakulásáért és akut myeloid leukémiává történő progressziójáért.

Mindössze egy évtizeden belül az új, genomszintű technológiák, például a következő generációs szekvenálás (NGS) elérhetősége forradalmasította az alapkutatást. Az NGS-analízis rutinszerű klinikai alkalmazása olyan jól bevált diagnosztikai eszközökkel együtt, mint a kromoszómasávok elemzése vagy a fluoreszcencia in situ hibridizáció, jelentősen kiegészíti a meglévő diagnosztikai és prognosztikai kritériumokat. Ez az átfogó kombinált megközelítés forradalmasíthatja a betegek kezelését. Azonban keveset tudunk az ilyen technikák rutin diagnosztikában való alkalmazásáról, és még mindig hiányoznak az ilyen elemzésekre vonatkozó szabványok.

A kutatócsoport legutóbbi publikációjában (DOI cikk: 10.1002/ajh.25089) bebizonyosodott, hogy a perifériás vérsejtek analízise (diagnóziskor) NGS-sel megvalósítható, és egyenértékű a csontvelősejtekből (BMC) kapott eredményekkel, amely jelenleg a legtöbb molekuláris diagnosztikai elemzés aranystandardja.

A csontvelő-aspirátumok súlyos és a beteg számára fájdalmas gyűjteményétől függően már nem, most már lehetőség nyílik MDS-betegek perifériás vérének rövid időközönkénti átfogó genetikai analízisére a rosszindulatú sejt klonális evolúciójának mintázatainak/útvonalainak kimutatására és szoros figyelemmel kísérésére. populáció rutin diagnosztikai környezetben. A tanulmányból nyert adatok várhatóan lényegesen hozzá fognak járulni:

1. Ismerje meg az azonosított mutációk funkcionális jelentőségét és a kombinált mutációk következményeit.
2. Az NGS-ből származó eredményeket a bevett genetikai módszerek (hagyományos citogenetika, FISH) adataival együtt sűrítsük össze, hogy átfogó képet kapjunk az MDS genetikáról és annak dinamikájáról, figyelembe véve e megközelítés egyes összetevőinek erősségeit és gyengeségeit.
3. Mutassa be, hogy a perifériás vér megfelelő minta lehet az NGS-követő vizsgálatok elvégzéséhez.

Spanyolországból származó, nagyon alacsony, alacsony és közepes kockázatú MDS-betegek sorozatában a tervek szerint retrospektív módon NGS-t (célzott mély szekvenálást) végeznek a diagnózis és az egymást követő nyomon követési minták alapján, kiválasztva azokat az eseteket, amelyek a betegség progressziójának jeleit mutatták.

Módszertan

Figyelembe véve az MDS előfordulását a térségben, évente 100 MDS-betegtől terveznek mintát venni (a projekt első 2 évében) nagyon alacsony, alacsony és közepes kockázatú kategóriába sorolva.

Minden begyűjtött mintát hagyományos citogenetikai módszerrel elemeznek (rutinszerűen a diagnosztikai tesztek részeként), és SF3B1 mutációanalízist is végeznek az alacsony kockázatú betegek gyakori elváltozásainak kiszűrése érdekében. Ily módon a betegek jobb jellemzése valósul meg, és személyre szabott kezelési lehetőségeket kínálnak az egyes betegek kockázatának megfelelően.

A szakirodalom szerint körülbelül 5-15%-uk várhatóan magas/nagyon magas kockázatú MDS altípusba vagy akut myeloid leukémiába (AML) fejlődik. Az NGS csak azokat az eseteket elemzi visszamenőleg, amelyek a betegség progressziójának jeleit mutatják.

A következő kritériumokat kell figyelembe venni a betegek felvételénél:

Bevételi kritériumok:

• Az MDS-re vonatkozó felülvizsgált nemzetközi prognózispontozási rendszer (IPSS-R) szerint a betegek nagyon alacsony, alacsony vagy közepes kockázatúak.
• Azok a betegek, akik megfelelnek az előző kritériumoknak, és nem részesülnek semmilyen kezelésben, vagy csak támogató kezelésben részesülnek (eritropoetin elfogadható).

Kizárási kritériumok:

• Az Egészségügyi Világszervezet (WHO) 2017-es osztályozása szerint "MDS izolált del(5q)" diagnózisban szenvedő betegek.
• Bármilyen betegségmódosító terápiában részesülő betegek (pl. hipometilező szerek).

A progresszió meghatározása: evolúció a magas/nagyon magas kockázatú MDS altípusba vagy az AML-be.

Perifériás vér (PB) és csontvelő (BM) mintákat gyűjtenek és tárolnak a diagnózis pillanatában. A PB mintákat 6 havonta gyűjtik, és a betegség progressziója idején (milyen kezelés előtt) BM mintát is gyűjtenek.

A diagnosztikai BM-mintákban DNS-kivonást végeznek, az SF3B1 gént pedig minden esetben Sanger-szekvenálással elemezzük.

Becslések szerint az NGS összesen 40 esetet vizsgál meg, 20 olyan beteget, akiknél várhatóan a betegség progresszióját mutatják, és 20 olyan beteget, akinél nincs progresszió:

• Azokat az eseteket, amelyek a betegség progresszióját mutatják, az NGS retrospektív módon elemzi. Becslések szerint a betegek 10%-a előrehaladhat, várhatóan évente 10 új beteget vonnak be (a projekt első két évében) a molekuláris elemzésbe. Ez összesen 20 beteget jelent 2 év utánkövetés után.
• Az NGS-t teljes BM és PB párosított mintákból származó DNS-ben hajtják végre a diagnózis és a progresszió pillanatában. A kettő közötti három PB nyomon követési mintát is elemzik a klonális dinamika nyomon követése érdekében. Ez összesen 7 mintát jelent minden előrehaladó betegenként (1. ábra).
• Ezenkívül 20 progresszió nélküli beteget is megvizsgálnak annak érdekében, hogy kiderítsék, van-e eltérés a mutációs spektrumban a betegség progressziójának eseteihez képest. Ugyanazokat az időpontokat veszik figyelembe, amelyeket az előrehaladott eseteknél vettek figyelembe, ezeknél a nem előrehaladott eseteknél is.

A következő 40 gén betegségre vonatkozó régióit tartalmazó géncsoportot vizsgálnak meg:

ASXL1, ASXL2, BCOR, BCORL1, BRAF, CALR, CBL, CEBPA, CSF3R, CSNK1A1, DNMT3A, EZH2, ETV6, FLT3, GATA1, GATA2, IDH1, IDH2, JAK2, KIT, KMT2A, MLL, KRNF1 , NPM1, NRAS, PTPN11, RAD21, RUNX1, SETBP1, SF3B1, SMC3, SRSF2, STAG1, STAG2, TET2, TP53, U2AF1, WT1, ZRSR2.

A betegek és a kapcsolódó minták adatai egy egyedi adatbázisban kerülnek rögzítésre. Minden klinikai adatot a Spanyol Myelodysplasiás Szindrómák Csoportja (GESMD) által meghatározott paraméterek szerint gyűjtenek. A projektben részt vevő összes pácienst felkérik, hogy kutatási célból kitöltse és aláírja a beleegyező nyilatkozatot, amelyet az ICO-Hospital Germans Trias i Pujol (Badalona, ​​Barcelona, ​​Spanyolország) etikai bizottsága hagyott jóvá. Minden protokoll összhangban lesz a Helsinki Nyilatkozattal és az adatok bizalmas kezelésére vonatkozó nemzeti normákkal (LOPD).

A bioinformatikai elemzéseket a Josep Carreras Leukémia Kutatóintézetben (IJC Campus ICO-GTIP) végzik. Badalona, ​​Spanyolország). Az adatmennyiség miatt minden egyes elemzést egy klaszteres számítástechnikai központban kell lefuttatni, és egy speciális tárolórendszerben kell tárolni, amely megfelel a jelenlegi spanyol adatvédelmi törvényeknek.