Studi sulle risposte adattive all'ipossia (HYKRAND)

Le complicanze del diabete rappresentano la principale preoccupazione per la moderna terapia del diabete ed è diventata una priorità caratterizzare ulteriormente i meccanismi fisiopatologici di queste complicanze per garantire lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche razionali.

Sebbene l'esposizione prolungata dei tessuti all'iperglicemia sia il principale fattore causale delle complicanze croniche del diabete, recentemente è diventato sempre più evidente che anche l'ipossia svolge un ruolo importante in tutte le complicanze del diabete. Una bassa concentrazione tissutale di ossigeno nel diabete è la conseguenza di diversi meccanismi (ad esempio, insufficiente apporto di sangue a causa di malattie micro e macrovascolari, scarsa diffusione locale di ossigeno a causa di edema locale o come risultato di un aumento del consumo di ossigeno).

Le risposte adattative delle cellule all'ipossia sono mediate dal fattore 1 inducibile dall'ipossia (HIF), che è un fattore di trascrizione eterodimerico composto da e subunità, che sono entrambe costitutivamente espresse nelle cellule di mammifero. La regolazione dell'attività HIF dipende in modo critico dalla degradazione delle subunità nella normossia. In condizioni ipossiche, l'HIF-1 è stabilizzato, si lega agli HRE (elementi responsivi ipossici) e sovraregola una serie genica coinvolta nell'angiogenesi, nel metabolismo energetico glicolitico, nella proliferazione cellulare e nella sopravvivenza, che consente alle cellule di adattarsi alla ridotta disponibilità di ossigeno . Si stima che più di 800 geni siano bersagli diretti di HIF. HIF-1 è centrale per l'espressione di molteplici fattori di crescita angiogenici (recensiti da [6]), reclutamento di cellule progenitrici endoteliali (EPC) . Recentemente, è stato proposto che i microRNA (es. mir210) mediano anche alcune funzioni HIF-1.

Diversi elementi di prova indicano una risposta difettosa dei tessuti diabetici all'ipossia. Una risposta di ipossia compromessa è presente in tutti i tessuti studiati negli animali diabetici e nei pazienti diabetici. L'iperglicemia reprime direttamente la stabilità e la funzione dell'HIF a più livelli, un meccanismo che non è completamente compreso.

Una reazione alterata all'ipossia nel diabete potrebbe avere conseguenze importanti nelle sfide ipossiche acute come infarto cardiaco acuto, ictus, ischemia degli arti ma anche nella sottile regolazione del sistema cardiovascolare e respiratorio come conseguenza della neuropatia autonomica con potenziale grave effetto prognostico sugli eventi cardiovascolari tardivi. Studi interventistici hanno affrontato le risposte cardiovascolari all'ipossia intermittente (IH) rispetto all'esposizione alla normossia nei pazienti con diabete. Tuttavia, al fine di stabilire l'adeguatezza della reazione cardiovascolare all'ipossia nel diabete, è necessario indagare le risposte cardiorespiratorie verso l'IH nei pazienti con diabete rispetto ai soggetti di controllo non diabetici abbinati. Inoltre si tratta essenzialmente di stabilire la risposta angiogenetica nello stesso disegno sperimentale. L'ipotesi per questo studio è che sia la reazione cardiorespiratoria mediata dal sistema nervoso autonomo che la risposta angiogenetica siano compromesse nei pazienti con diabete come conseguenza di una reazione HIF compromessa come si osserva in altri tessuti.

I ricercatori hanno in programma di studiare l'effetto dell'ipossia intermittente (IH) che consisterà in cinque periodi ipossici (frazione inspirata di ossigeno al 13% di ossigeno) ciascuno della durata di 6 minuti, con cinque intervalli normossici della stessa durata in 15 pazienti con diabete di tipo 1 senza clinica segni di neuropatia e in 15 controlli non diabetici appaiati per sesso, BMI, età. Lo studio verrà eseguito durante un giorno.

Metodi:

I dati di riferimento saranno ottenuti la mattina di ogni giorno di test almeno 2 ore dopo la colazione. Si consiglia ai soggetti di astenersi da bevande contenenti caffeina per 12 ore e da alcol per 36 ore prima del test.

La pressione sanguigna e la frequenza cardiaca e la saturazione di ossigeno arterioso saranno continuamente misurate. In caso di diminuzione della saturazione di ossigeno dell'80% o di comparsa di sintomi, l'ipossia sarebbe stata interrotta fino a quando i livelli di ossigeno non avessero raggiunto almeno l'80%. Un tecnico regolerà e controllerà i periodi di respirazione sotto la supervisione di un medico in modo che l'intervento non possa essere osservato da nessun paziente. Successivamente, verranno eseguite tre sessioni di misurazione: immediatamente dopo (t2), dopo 3 ore (t3) e dopo 6 ore (t4). Dopo t2, ogni paziente riceverà un pasto individuale in base alle esigenze dietetiche.

Test cardiovascolari e respiratori.

La risposta ventilatoria ipossica (HVR) e la risposta ventilatoria ipercapnica (HCVR) saranno valutate per determinare l'attività del sistema respiratorio. Tutti i pazienti saranno testati in posizione supina in una stanza silenziosa a temperatura confortevole. Prima che i partecipanti vengano collegati a un circuito di respirazione attraverso un boccaglio con un filtro antibatterico, verrà eseguita la respirazione spontanea dell'aria della stanza a riposo per 4 minuti al fine di ottenere dati di base.

Durante ciascuna condizione, gli investigatori eseguiranno la misurazione continua della saturazione dell'ossigeno (SaO2) mediante un pulsossimetro e la CO2 di fine espirazione (CO2-et) utilizzando un capnografo collegato a un boccaglio. Le registrazioni dell'elettrocardiogramma verranno eseguite mediante derivazioni toraciche e la pressione sanguigna continua non invasiva verrà registrata utilizzando il metodo del bracciale. Uno pneumotacografo Fleish riscaldato sarà collegato a un trasduttore di pressione differenziale e inserito in serie al componente espiratorio del sistema di rirespirazione per misurare il flusso delle vie aeree. Per la misurazione della risposta all'ipossia, i partecipanti saranno collegati a un circuito di rirespirazione che induce una progressiva diminuzione della SaO2 mantenendo i valori di CO2-et a livelli costanti, fino a quando la SaO2 raggiunge l'80%, e misurando i cambiamenti da respiro a respiro nella ventilazione minuto . La risposta all'ipercapnia sarà valutata dai cambiamenti ventilatori indotti dal progressivo aumento dei livelli di CO2-et (fino a 13 mmHg sopra i livelli di riposo), mentre la SaO2 sarà mantenuta al 98% dall'ossigeno a bassissimo flusso.

La funzione autonomica cardiovascolare sarà determinata eseguendo quattro test secondo le recenti linee guida: respirazione profonda, rapporto 30:15, manovra di Valsalva e risposta della pressione arteriosa sistolica alla posizione eretta. La neuropatia autonomica cardiovascolare sarà definita come la "presenza di due o più test anomali".

Misurazione della sensibilità del chemoreflex: la pendenza della linea di regressione lineare della ventilazione minuto rispetto a SaO2 o CO2-et indica in ciascun caso la sensibilità del chemoreflex all'ipossia o all'ipercapnia. Nel test ipercapnico, il punto in cui la ventilazione inizia ad aumentare indica come soglia di reclutamento del ventilatore alla CO2 (VRT-CO2). La VRT-CO2 sarà identificata interpolando il grafico ventilazione/CO2-et con una funzione polinomiale del quarto ordine.

Valutazione della sensibilità baroriflessa: La sensibilità baroriflessa (BRS) verrà misurata durante la respirazione spontanea in ogni sessione di misurazione. Poiché gli studi precedenti non hanno documentato una migliore prestazione di un metodo rispetto agli altri, i ricercatori calcoleranno la media di sette diversi metodi: sequenze positive e negative, il coefficiente a nelle bande di bassa e alta frequenza e la sua media, il tecnica della funzione di trasferimento e il rapporto tra SD dell'intervallo RR e variabilità della pressione arteriosa sistolica. Oltre alla BRS, verrà applicata la SD dell'intervallo R-R (SDNN) per determinare un indice globale di variabilità della frequenza cardiaca. Questa selezione viene effettuata in base al fatto che la distribuzione normale è più pronunciata in questa variabile rispetto ad altri indici di variabilità (ad esempio, la varianza). La risposta ventilatoria ipossica (HVR) e la risposta ventilatoria ipercapnica (HCVR), la sensibilità baroriflessa (BRS) saranno valutate prima (t1), immediatamente dopo (t2), 3 h (t3) e 6 h (t4) dopo IH.

Il potenziale angiogenetico sarà valutato agli stessi endpoint misurando nel siero le citochine rilevanti che sono bersagli genici per HIF-1 (es. VEGFA, SDF-1a, eritropoietina ecc.). La risposta diretta del segnale HIF sarà valutata dai livelli sierici di mir210 regolati esclusivamente da HIF.

La risposta assoluta dell'account delle cellule precursori endoteliali (EPC) sarà valutata allo stesso tempo mediante l'analisi FACS del numero di CD34+/CD133+/KDR+