Studio sierologico della dengue e caratterizzazione della risposta immunitaria in dieci città endemiche e non endemiche del Messico

La dengue è una malattia di importanza epidemiologica nei paesi tropicali e subtropicali. La regione delle Americhe è una delle più colpite al mondo, dove quasi 500 milioni di persone sono a rischio di contrarre la malattia da uno dei quattro sierotipi del virus Dengue (DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4) trasmessa principalmente dalla puntura della zanzara Aedes aegypty. È una malattia soggetta a sorveglianza epidemiologica basata sulla definizione operativa di un probabile caso di dengue non grave, un probabile caso di dengue con segni premonitori e un probabile caso di dengue grave. La diagnosi clinica viene posta durante la fase febbrile fino a cinque giorni di evoluzione, mediante RT-qPCR e nella fase di convalescenza, da sei a quattordici giorni dopo la data di insorgenza dei sintomi, con un saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) IgM o IgG. Sebbene i sistemi di sorveglianza epidemiologica siano strumenti essenziali per la descrizione della malattia e il processo decisionale, si è ritenuto che potessero fornire informazioni sottostimate sul peso della malattia.

Circa il 75% delle infezioni da DENV sono lievi o asintomatiche e le manifestazioni cliniche più comuni sono febbre, cefalea, dolore retroorbitale, mialgia, artralgia e nausea. L'infezione primaria può produrre una risposta immunitaria sierotipo-specifica per tutta la vita e una risposta incrociata contro i diversi sierotipi DENV per un periodo compreso tra sei mesi e un anno (immunità eterologa di breve durata), ma dopo questo periodo il profilo protettivo risultante è noto come una risposta monotipica, quindi, l'attività neutralizzante è solo contro un sierotipo. La seconda infezione, solitamente causata da un sierotipo diverso, potrebbe essere associata ad un aumentato rischio di sviluppare manifestazioni gravi; quelli che risolvono l'infezione sviluppano un profilo anticorpale simile a quello generato nella prima infezione (peccato originale antigenico), ma a differenza della prima infezione, la conseguente risposta immunitaria umorale incrociata eterologa dura più a lungo; Le successive infezioni, normalmente asintomatiche, se effettuate, intensificano questo profilo di anticorpi come risposta multitipo o contro due o più sierotipi. Sebbene l'immunità protettiva contro il virus dengue sia ancora in fase di studio, si ritiene che il profilo multitipo, sviluppato dall'esposizione a più sierotipi del virus, sia quello correlato alla protezione contro la malattia e pertanto sia desiderabile svilupparsi mediante un candidato al vaccino.

Un altro aspetto rilevante della trasmissione della dengue è che le località che sviluppano uno stato iperendemico sono quelle in cui si dovrebbero trovare più frequentemente profili multitipici poiché questi possono essere generati solo dalla circolazione di più di un sierotipo. D'altra parte, le comunità con la circolazione di un sierotipo o in cui la circolazione di più di un sierotipo è ampiamente separata nel tempo avrebbero profili monotipici che distinguono le comunità non endemiche.

Le misure preventive includono principalmente quelle relative alla promozione della salute e al controllo dei vettori. Un vaccino è stato registrato (CYD-TDV, chimera della febbre gialla 17D-DENV) e altri cinque sono in fase di studio. L'Organizzazione Mondiale della Sanità ha chiesto lo svolgimento di indagini sierologiche come strumenti chiave per informare le politiche pubbliche sulla prevalenza della malattia e guidare il processo decisionale. Ciò è più rilevante poiché il vaccino CYD-TDV e il vaccino TAK-003 (DENV-DENV chimera) hanno mostrato un comportamento differenziato tra soggetti sieronegativi e sieropositivi e il vaccino CYD-TDV è stato registrato per uso esclusivo per regioni e località endemiche. Inoltre, è stata segnalata un'associazione tra la storia vaccinale e la gravità della malattia nella popolazione di età inferiore ai 9 anni. Pertanto, è importante conoscere la risposta immunitaria umorale in questa fascia di età. Le indagini sierologiche hanno facilitato la documentazione del ruolo dei fattori clinici, sociali e ambientali nella prevalenza della malattia e nella sua eterogeneità a livello mondiale. La prevalenza della dengue nelle aree endemiche è stata segnalata intorno all'80%, mentre nelle aree non endemiche è inferiore al 30%. Anche l'età è stata descritta come un fattore associato alla prevalenza della dengue in Messico, è stata segnalata una prevalenza del 35,7% nel gruppo di 5-9 anni, seguita dal 52,2% nel gruppo di 10-14 anni, 58,9 % nel gruppo dai 15 ai 19 anni, 74,1% nel gruppo dai 20 ai 24 anni, 80% nel gruppo dai 25 ai 29 anni e oltre il 90% nel gruppo dai 30 anni. Anche le infrastrutture e i fattori sociali sono stati documentati come determinanti dell'endemicità della dengue.

Gli studi sulla sieroprevalenza della dengue condotti in Messico sono stati studi osservazionali su popolazioni endemiche; Esiste un solo studio nazionale randomizzato a grappolo che fornisce una descrizione globale della sieroprevalenza nelle regioni endemiche e non endemiche e la risposta umorale neutralizzante sierotipo-specifica non è stata valutata da Amaya-Larios et al, 2014; pertanto, vi è una mancanza di conoscenza del tipo di risposta immunitaria umorale che si verifica nelle località endemiche e non endemiche. La conoscenza delle caratteristiche generali delle città con profili monotipici o multitipici ci consentirà di offrire informazioni cruciali a vari livelli. Per le aziende farmaceutiche, conoscere lo stato immunitario delle città del Paese consentirà di stabilire i luoghi migliori in cui è possibile condurre studi clinici per stabilire l'efficacia e la sicurezza dei candidati al vaccino; Per le istituzioni incaricate di elaborare le possibili politiche pubbliche di vaccinazione, conoscere le caratteristiche generali delle località in cui è noto il profilo di risposta immunitaria e l'incidenza della malattia, consentirà di estrapolare queste informazioni in località in cui è nota solo l'incidenza; Per la comunità scientifica internazionale, i risultati del progetto proposto contribuiranno alla conoscenza delle caratteristiche di popolazione della trasmissione endemica della dengue e della sua relazione con i cicli endemico-epidemici che sono caratteristici del comportamento di questa malattia.

Domanda di ricerca: qual è la distribuzione e la caratterizzazione della risposta immunitaria umorale da parte del sierotipo DENV nelle aree a bassa e alta endemicità della dengue in Messico? Ipotesi: nelle aree con bassa endemicità della dengue, la risposta umorale contro la dengue è prevalentemente monotipica, mentre nelle aree ad alta endemicità per la dengue è prevalentemente multitipica.

Obiettivi GENERALI

• Caratterizzare il tipo predominante di risposta immunitaria umorale nelle persone di età compresa tra 5 e 35 anni che vivono in città messicane con bassa e alta endemicità di dengue.

SPECIFICA

• Stimare la prevalenza generale di anticorpi (IgG) contro DENV nella popolazione dello studio.
• Determinare il titolo anticorpale neutralizzante contro DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4 nella popolazione dello studio.
• Determinare la frequenza del tipo di risposta umorale monotipica e multitipica nelle città in base alla loro endemicità.

Metodologia Disegno dello studio: studio osservazionale descrittivo trasversale con raccolta di dati prospettici.

Popolazione target: Popolazione residente di aree urbane endemiche e non endemiche per la dengue.

Popolazione in studio: soggetti di età compresa tra 5 e 35 anni residenti in località selezionate con alta e bassa endemicità per la dengue.

Criteri di inclusione ed esclusione: descritti di seguito come ammissibilità

Sample Size Calculation: è stato effettuato nel programma OpenEpi, Versione 3 considerando le prevalenze riportate da studi precedenti ed estrapolando le informazioni disponibili da alcune città sul grado di endemicità della dengue per quelle località in cui non erano disponibili informazioni ( 16, 20 -21) La formula per il calcolo della dimensione del campione era:

n = [DEFF * Np (1-p)] / [(d2 / Z21-α / 2 * (N-1) + p * (1-p)] In totale, dovranno essere campionate 2.421 persone. La selezione dei partecipanti sarà effettuata mediante un campionamento in due fasi (per gruppi di due fasi) per ciascuna delle località di studio. Nella prima fase, i blocchi (n = 50) verranno selezionati casualmente in ciascuna località e successivamente, nella seconda fase, verrà selezionata una casa all'interno di ciascun blocco, a partire dalla prima casa all'angolo nord-est del blocco, se questo casa non accetta, l'operatore comunitario continuerà a destra fino a quando almeno una persona di una famiglia, che soddisfa i criteri di selezione, accetterà di partecipare.

ELISA IgG indiretto per stimare la sieroprevalenza: La sieropositività sarà valutata con ELISA IgG indiretto seguendo le istruzioni del produttore Panbio E-DEN 01 G, che ha una specificità del 98% e una sensibilità del 100%.

Titoli anticorpali neutralizzanti sierotipo-specifici: Per stabilire il tipo di immunità umorale che la città selezionata presenta, la misurazione dei titoli anticorpali neutralizzanti verrà effettuata attraverso il test di neutralizzazione riducendo il numero di placche litiche al 50% (PRNT50%), utilizzando cellule Vero e i seguenti ceppi di riferimento per ciascun sierotipo: DENV-1 (HAWAI), DENV-2 (NUOVA GUINEA), DENV-3 (H-887) e DENV-4 (H-24).

Il tipo di immunità umorale sarà classificato in risposta immunitaria monotipica se vengono rilevati solo anticorpi contro un singolo sierotipo DENV e risposta immunitaria multitipica, se vengono rilevati anticorpi contro più di un singolo sierotipo DENV.

Raccolta e gestione delle informazioni: le informazioni saranno raccolte in un formato standard. Il sondaggio sarà compilato dall'intervistatore (personale del progetto) sulla base delle istruzioni di compilazione. Le informazioni saranno acquisite su sondaggi stampati e gestite da data logger addestrati nel database elettronico progettato a tale scopo.

Gli esiti delle prove di laboratorio verranno gestiti solo con il folio assegnato a ciascun partecipante e gli esiti verranno inseriti in un database realizzato in Excel® dal personale del laboratorio. Il database includerà il foglio, la data del risultato e il risultato. Le informazioni nominali del sondaggio saranno mantenute separate dal resto delle informazioni, identificando le persone solo attraverso il loro numero di foglio e proteggendo la loro identità.

Le variabili qualitative saranno descritte con frequenze assolute e relative, e le variabili quantitative saranno descritte con misure di tendenza centrale e dispersione considerando la distribuzione di ciascuna variabile. La prevalenza di IgG contro DENV sarà determinata con i rispettivi intervalli di confidenza al 95% (IC 95%) per la popolazione totale dello studio, nonché per ciascuna località, per gruppo di età e per sesso. Allo stesso modo, sarà determinata la prevalenza di anticorpi neutralizzanti per sierotipi specifici e la frequenza di risposte monotipiche e multiple in questi stessi sottogruppi.

Considerazioni etiche: questo studio è un'indagine con un rischio minimo, in cui saranno presi in considerazione solo i soggetti che accettano di partecipare volontariamente. Ai soggetti maggiorenni verrà chiesto di firmare il consenso informato, in cui viene accreditata la loro partecipazione volontaria; In caso di minori verrà richiesta la firma del consenso informato del genitore o del tutore e se il minore ha un'età compresa tra i 7 e i 17 anni verrà richiesta la firma del consenso informato.

Il processo di sicurezza dei dati consisterà nel separare le informazioni nominali del sondaggio dal resto delle informazioni, queste verranno archiviate in due tabelle che saranno identificate con una chiave di identificazione comune, per proteggere l'identità delle persone.

Considerazioni sulla biosicurezza: la gestione dei rifiuti biologici pericolosi infetti è specificata in questo documento. In generale i materiali a contatto con virus o sangue o loro derivati ​​verranno clorati per 30 minuti con una soluzione di ipoclorito di sodio al 5% e successivamente verranno gettati in un sacchetto rosso. Gli aghi verranno conservati in un contenitore per oggetti taglienti conforme alle linee guida locali NOM-087.