Estudo sorológico da dengue e caracterização da resposta imune em dez cidades endêmicas e não endêmicas do México

A dengue é uma doença de importância epidemiológica em países tropicais e subtropicais. A região das Américas é uma das mais afetadas no mundo, onde cerca de 500 milhões de pessoas correm o risco de adquirir a doença de um dos quatro sorotipos do vírus da Dengue (DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4) transmitida principalmente pela picada do mosquito Aedes aegypty. É uma doença sujeita a vigilância epidemiológica baseada na definição operacional de caso provável de dengue não grave, caso provável de dengue com sinais de alerta e caso provável de dengue grave. O diagnóstico clínico é feito durante a fase febril até cinco dias de evolução, através de RT-qPCR e na fase de convalescença, seis a quatorze dias após a data de início dos sintomas, com ensaio imunoenzimático (ELISA) IgM ou IgG. Embora os sistemas de vigilância epidemiológica sejam ferramentas essenciais para a descrição de doenças e tomada de decisão, considera-se que eles podem fornecer informações subestimadas sobre a carga da doença.

Cerca de 75% das infecções por DENV são leves ou assintomáticas, e as manifestações clínicas mais comuns são febre, cefaléia, dor retro-orbitária, mialgia, artralgia e náusea. A infecção primária pode produzir uma resposta imune sorotipo-específica ao longo da vida e uma resposta cruzada contra os diferentes sorotipos DENV por um período entre seis meses e um ano (imunidade heteróloga de curta duração), mas após esse período o perfil protetor resultante é conhecido como uma resposta monotípica, então, a atividade neutralizante é apenas contra um sorotipo. A segunda infecção, geralmente causada por um sorotipo diferente, pode estar associada a um risco aumentado de desenvolver manifestações graves; aqueles que resolvem a infecção desenvolvem um perfil de anticorpos semelhante ao gerado na primeira infecção (pecado original antigênico), mas diferentemente da primeira infecção, a resposta imune humoral cruzada heteróloga resultante dura mais tempo; Infecções posteriores, normalmente assintomáticas, se realizadas, intensificam esse perfil de anticorpos como resposta multitipo ou contra dois ou mais sorotipos. Embora a imunidade protetora contra o vírus da Dengue ainda esteja em estudo, considera-se que o perfil multitipo, desenvolvido pela exposição a múltiplos sorotipos do vírus, é aquele que está relacionado à proteção contra a doença e, portanto, é desejável desenvolver-se por um candidato a vacina.

Outro aspecto relevante da transmissão da dengue é que as localidades que desenvolvem um estado hiperendêmico são aquelas onde os perfis multitípicos devem ser encontrados com maior frequência, pois estes só podem ser gerados pela circulação de mais de um sorotipo. Por outro lado, comunidades com circulação de um sorotipo ou onde a circulação de mais de um sorotipo é amplamente separada no tempo teriam perfis monotípicos que distinguem comunidades não endêmicas.

As medidas preventivas incluem principalmente aquelas relacionadas à promoção da saúde e controle de vetores. Uma vacina foi registrada (CYD-TDV, febre amarela quimera 17D-DENV) e outras cinco estão em estudo. A Organização Mundial de Saúde apelou à realização de inquéritos serológicos como instrumentos-chave para informar as políticas públicas sobre a prevalência da doença e orientar a tomada de decisões. Isso é mais relevante porque a vacina CYD-TDV e a vacina TAK-003 (DENV-DENV quimera) apresentaram comportamento diferenciado entre soronegativos e soropositivos e a vacina CYD-TDV foi registrada para uso exclusivo em regiões e localidades endêmicas. Além disso, foi relatada associação entre o histórico de vacinação e a gravidade da doença na população com menos de 9 anos de idade. Portanto, é importante conhecer a resposta imune humoral nessa faixa etária. Inquéritos sorológicos têm facilitado a documentação do papel de fatores clínicos, sociais e ambientais na prevalência da doença e sua heterogeneidade em todo o mundo. A prevalência de dengue em áreas endêmicas é de cerca de 80%, enquanto em áreas não endêmicas é inferior a 30%. A idade também foi descrita como um fator associado à prevalência de dengue no México, foi relatada uma prevalência de 35,7% no grupo de 5 a 9 anos, seguida de 52,2% no grupo de 10 a 14 anos, 58,9 % no grupo de 15 a 19 anos, 74,1% no grupo de 20 a 24 anos, 80% no grupo de 25 a 29 anos e mais de 90% no grupo de 30 anos. Infraestrutura e fatores sociais também foram documentados como determinantes da endemicidade da dengue.

Estudos de soroprevalência de dengue realizados no México foram estudos observacionais em populações endêmicas; Existe apenas um estudo nacional randomizado por cluster que fornece uma descrição global da soroprevalência em regiões endêmicas e não endêmicas, e a resposta humoral neutralizante específica do sorotipo não foi avaliada por Amaya-Larios et al, 2014; portanto, há um desconhecimento do tipo de resposta imune humoral que ocorre em localidades endêmicas e não endêmicas. O conhecimento das características gerais das cidades com perfis monotípicos ou multitípicos nos permitirá oferecer informações cruciais em vários níveis. Para as empresas farmacêuticas, conhecer o estado imunológico das cidades do país permitirá estabelecer os melhores locais onde podem ser realizados estudos clínicos para estabelecer a eficácia e segurança das vacinas candidatas; Para as instituições responsáveis ​​pela elaboração das possíveis políticas públicas de vacinação, o conhecimento das características gerais das localidades onde se conhece o perfil de resposta imune e a incidência da doença, permitirá extrapolar esta informação em localidades onde se conhece apenas a incidência; Para a comunidade científica internacional, os resultados do projeto proposto contribuirão para o conhecimento das características populacionais da transmissão endêmica da dengue e sua relação com os ciclos endêmico-epidêmicos distintivos do comportamento dessa doença.

Questão de pesquisa: Qual é a distribuição e caracterização da resposta imune humoral pelo sorotipo DENV em áreas de baixa e alta endemicidade de dengue no México? Hipótese: Em áreas com baixa endemicidade de dengue, a resposta humoral contra dengue é predominantemente monotípica, enquanto em áreas de alta endemicidade para dengue é predominantemente multitípica.

Objetivos GERAL

● Caracterizar o tipo predominante de resposta imune humoral em pessoas de 5 a 35 anos de idade que vivem em cidades mexicanas com baixa e alta endemicidade de dengue.

ESPECÍFICO

• Estimar a prevalência geral de anticorpos (IgG) contra DENV na população do estudo.
• Determine o título de anticorpo neutralizante contra DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4 na população do estudo.
• Determine a frequência do tipo de resposta humoral monotípica e multitípica em cidades com base em sua endemicidade.

Metodologia Desenho do estudo: Estudo observacional descritivo transversal com coleta de dados prospectiva.

População alvo: População residente em áreas urbanas endêmicas e não endêmicas para dengue.

População do estudo: Indivíduos de 5 a 35 anos residentes em localidades selecionadas com alta e baixa endemicidade para dengue.

Critérios de inclusão e exclusão: descritos abaixo como elegibilidade

Cálculo do tamanho da amostra: foi realizado no programa OpenEpi, versão 3, considerando as prevalências relatadas em estudos anteriores e extrapolando as informações disponíveis de algumas cidades sobre o grau de endemicidade da dengue para aquelas localidades em que não havia informações disponíveis ( 16, 20 -21) A fórmula para o cálculo do tamanho da amostra foi:

n = [DEFF * Np (1-p)] / [(d2 / Z21-α / 2 * (N-1) + p * (1-p)] No total, 2.421 pessoas precisarão ser amostradas. A seleção dos participantes será realizada por amostragem em dois estágios (por conglomerados de dois estágios) para cada uma das localidades do estudo. Na primeira etapa serão sorteados quarteirões (n = 50) em cada localidade e posteriormente, na segunda etapa, será sorteada uma casa dentro de cada quarteirão, iniciando com a primeira casa no canto nordeste do quarteirão, se esta casa não aceitar, o agente comunitário continuará à direita até que pelo menos uma pessoa da família, que atenda aos critérios de seleção, concorde em participar.

IgG ELISA indireto para estimar a soroprevalência: A soropositividade será avaliada com IgG ELISA indireto seguindo as instruções do fabricante Panbio E-DEN 01 G, que tem especificidade de 98% e sensibilidade de 100%.

Títulos de anticorpos neutralizantes sorotipo-específico: Para estabelecer o tipo de imunidade humoral que a cidade selecionada apresenta, será realizada a medição dos títulos de anticorpos neutralizantes por meio do teste de neutralização reduzindo o número de placas líticas para 50% (PRNT50%), usando células Vero e as seguintes cepas de referência para cada sorotipo: DENV-1 (HAWAI), DENV-2 (NOVA GUINÉ), DENV-3 (H-887) e DENV-4 (H-24).

O tipo de imunidade humoral será classificado em resposta imune monotípica se forem detectados apenas anticorpos contra um único sorotipo de DENV, e resposta imune multitípica, se forem detectados anticorpos contra mais de um único sorotipo de DENV.

Coleta e gerenciamento de informações: As informações serão coletadas em um formato padrão. A pesquisa será preenchida pelo entrevistador (equipe do projeto) com base nas instruções de preenchimento. As informações serão capturadas em pesquisas impressas e gerenciadas por registradores de dados treinados no banco de dados eletrônico projetado para essa finalidade.

Os resultados dos exames laboratoriais serão gerenciados apenas com a folha atribuída a cada participante e os resultados serão lançados em um banco de dados elaborado em Excel® pela equipe do laboratório. O banco de dados incluirá o fólio, a data do resultado e o resultado. As informações nominais da pesquisa serão mantidas separadas do restante das informações, identificando os indivíduos apenas pelo número do cadastro e resguardando sua identidade.

As variáveis ​​qualitativas serão descritas com frequências absolutas e relativas, e as variáveis ​​quantitativas serão descritas com medidas de tendência central e dispersão considerando a distribuição de cada variável. A prevalência de IgG contra DENV será determinada com os respectivos intervalos de confiança de 95% (IC 95%) para a população total do estudo, bem como para cada localidade, por faixa etária e por sexo. Da mesma forma, serão determinadas a prevalência de anticorpos neutralizantes para sorotipos específicos e a frequência de respostas monotípicas e múltiplas nesses mesmos subgrupos.

Considerações éticas: Este estudo é uma investigação de risco mínimo, na qual serão considerados apenas os sujeitos que concordarem em participar voluntariamente. Para os maiores de idade, será solicitada a assinatura do consentimento informado, no qual se acredita a sua participação voluntária; No caso de menores será solicitada a assinatura do consentimento informado do progenitor ou tutor e se o menor tiver entre 7 e 17 anos será solicitada a assinatura do consentimento informado.

O processo de segurança dos dados consistirá em separar a informação nominal do inquérito do resto da informação, esta será armazenada em duas tabelas que serão identificadas com uma chave de identificação comum, para proteger a identidade das pessoas.

Considerações de biossegurança: A gestão de resíduos perigosos biológicos infecciosos é especificada neste documento. Em geral, materiais em contato com vírus ou sangue ou seus derivados serão clorados por 30 minutos com solução de hipoclorito de sódio 5% e posteriormente descartados em saco vermelho. As agulhas serão armazenadas em um recipiente para objetos cortantes que esteja em conformidade com as diretrizes locais NOM-087.