Diradamento della zona pellucida rispetto alla perforazione durante la schiusa assistita da laser

Verranno arruolati duecento cicli (100 assottigliamenti laser e 100 forature laser assistite).

Tutti i partecipanti allo studio saranno sottoposti a stimolazione ovarica controllata mediante protocollo lungo agonista del GnRH a partire dalla fase medio-luteale. La completa soppressione ipofisaria sarà confermata da un livello sierico di E2 inferiore a 30 pg/ml e da un livello sierico di LH inferiore a 2 mIU/ml, quindi la terapia con gonadotropine verrà iniziata dal giorno 2 fino al giorno di maturazione confermato dalla presenza di 3 follicoli maturi o più, uno di loro 18 mm; in questo momento verranno somministrate 10000 UI di hCG, quindi il prelievo dell'ovulo verrà effettuato 36 ore dopo la somministrazione di hCG sotto guida ecografica transvaginale Le masse cellulari del cumulo attorno agli ovociti verranno rimosse utilizzando pipette di denudazione pull-and-cut in un piatto di coltura a 5 pozzetti (MTG , Bruckberg, Germania) contenente 27 IU/mL di ialuronidasi.

Tutti gli ovociti che saranno maturi a 4-6 ore dalla raccolta degli ovociti saranno inseminati in base alla qualità degli spermatozoi e degli ovociti e alla precedente storia di fecondazione in vitro del paziente. La fecondazione sarà confermata 17-18 h dopo l'inseminazione dalla presenza di due distinti pronuclei. Gli zigoti saranno coltivati ​​in micro-gocce da 30 μL con un terreno a 1 passaggio e ricoperti con olio di paraffina in un'atmosfera di 6% CO2, 5% O2 e 95% di umidità a 37 °C. Gli embrioni disponibili saranno valutati in tutti i pazienti secondo i criteri di blastomeri uguali e regolari, numero di blastomeri vitali e rapporto di frammentazione.

LAH sarà condotto utilizzando un sistema laser con un laser a diodi da 1,48 μm a 300 m W attraverso assottigliamento o perforazione. Gli embrioni saranno sottoposti a LAT o LAD in micro-gocce da 10 a 20 μL costituite da G-MOPS plus medium. Gli embrioni verranno fissati nelle microgocce del microscopio invertito. La dimensione di un colpo laser sarà di 5 μm nello ZP utilizzando lo stesso numero totale di impulsi da 3000 μs. In LAT, l'obiettivo del metodo di assottigliamento è rendere più sottile la parte esterna dello strato protettivo esterno della glicoproteina. L'assottigliamento laser verrà eseguito praticando 2-3 fori senza raggiungere la membrana interna ad una profondità del 60-80% dello spessore ZP. In LAD, l'apertura laser sarà realizzata dall'esterno verso l'interno della ZP.

Il raggio laser sparato verso la ZP sopra lo spazio perivitellino tra due blastomeri per ridurre al minimo il rischio di danneggiare l'embrione, sotto attento controllo. Gli embrioni nella micro-goccia saranno lavati più volte dopo LAH e quindi trasferiti in una piastra a 1 pozzetto (Falcon 353,653, USA) contenente terreno di coltura G-2. LAH è stato eseguito da 2 a 3 ore prima del trasferimento dell'embrione. Gli embrioni saranno coltivati ​​in un'atmosfera con il 6% di CO2, il 5% di O2 e il 95% di umidità a 37 °C.