Przerzedzanie strefy przezroczystej a wiercenie podczas wylęgania wspomaganego laserem

Zarejestrowanych zostanie 200 cykli (100 przerzedzeń wspomaganych laserem i 100 wierceń wspomaganych laserem).

Wszystkie uczestniczki badania zostaną poddane kontrolowanej stymulacji jajników za pomocą długiego protokołu agonisty GnRH, począwszy od środkowej fazy lutealnej. Całkowita supresja przysadki zostanie potwierdzona poziomem E2 w surowicy poniżej 30 pg/ml i poziomem LH w surowicy poniżej 2 mIU/ml, wówczas leczenie gonadotropiną rozpocznie się od 2. dnia do dnia dojrzewania potwierdzonego obecnością 3 dojrzałych pęcherzyków lub więcej, jeden z nich 18 mm; w tym czasie zostanie podane 10000 j.m. hCG, a następnie pobranie komórki jajowej nastąpi 36 godzin po podaniu hCG pod kontrolą ultrasonografii przezpochwowej. Masy komórek wzgórkowatych wokół oocytów zostaną usunięte za pomocą pipet denudacyjnych typu pull-and-cut w 5-dołkowej płytce hodowlanej (MTG , Bruckberg, Niemcy) zawierające 27 IU/ml hialuronidazy.

Wszystkie komórki jajowe, które osiągną dojrzałość po 4-6 godzinach od pobrania zostaną poddane inseminacji w zależności od jakości plemników i komórek jajowych oraz wcześniejszej historii IVF pacjentki. Zapłodnienie zostanie potwierdzone 17-18 godzin po inseminacji przez obecność dwóch odrębnych przedjądrzy. Zygoty będą hodowane w 30-μl mikrokroplach z pożywką 1-etapową i pokryte olejem parafinowym w atmosferze 6% CO2, 5% O2 i 95% wilgotności w temperaturze 37°C. Dostępne zarodki zostaną ocenione u wszystkich pacjentek według kryteriów równych i regularnych blastomerów, liczby żywotnych blastomerów oraz współczynnika fragmentacji.

LAH zostanie przeprowadzone przy użyciu systemu laserowego z laserem diodowym 1,48 μm o mocy 300 mW poprzez przerzedzanie lub wiercenie. Zarodki zostaną poddane LAT lub LAD w 10- do 20-μL mikrokroplach składających się z G-MOPS plus pożywka. Zarodki zostaną utrwalone w mikrokroplach na odwróconym mikroskopie. Rozmiar jednego strzału laserowego wyniesie 5 μm w ZP przy użyciu tej samej łącznej liczby impulsów 3000 μs. W LAT celem metody przerzedzania jest zmniejszenie zewnętrznej części zewnętrznej ochronnej warstwy glikoproteinowej. Pocienianie laserowe zostanie wykonane poprzez wykonanie 2-3 otworów bez dotarcia do błony wewnętrznej na głębokości 60-80% grubości ZP. W LAD laserowe otwarcie zostanie wykonane od zewnątrz do wewnątrz ZP.

Wiązka laserowa wystrzeliła w kierunku ZP powyżej przestrzeni periwitelliny między dwoma blastomerami, aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia zarodka, pod ścisłą kontrolą. Zarodki w mikrokropli zostaną kilkakrotnie przemyte po LAH, a następnie przeniesione do 1-studzienkowej płytki (Falcon 353,653, USA) zawierającej pożywkę hodowlaną G-2. LAH wykonano 2 do 3 godzin przed transferem zarodków. Zarodki będą hodowane w atmosferze 6% CO2, 5% O2 i 95% wilgotności w temperaturze 37°C.