Stress cerebrale nitrosativo/ossidativo nell'emorragia subaracnoidea aneurismatica (NOX2)

SFONDO:

L'emorragia subaracnoidea aneurismatica (SAH) comporta un'elevata morbilità e mortalità. Ciò è in gran parte dovuto allo sviluppo di lesioni cerebrali secondarie, inclusa la complicanza dell'ischemia cerebrale ritardata (MDD), che colpisce il 30% dei sopravvissuti iniziali. I meccanismi alla base della lesione cerebrale secondaria dopo SAH sono compresi in modo incompleto.

L'ossido nitrico (NO) è un potente vasodilatatore endogeno prodotto dall'arginina dall'enzima ossido nitrico sintasi (NOS), che esiste in tre isoforme: NOS endoteliale, neuronale e inducibile (eNOS, nNOS e iNOS). In condizioni di infiammazione e stress ossidativo, i radicali liberi possono reagire con NO per formare perossinitrito (ONOO-), che è altamente reattivo e può danneggiare direttamente macromolecole biologiche come lipidi e proteine. Questo fenomeno, ovvero un'aumentata produzione di specie reattive dell'azoto che potenzialmente portano a danni cellulari, è definito stress nitrosativo.

È opinione diffusa che lo stress ossidativo/nitrosativo e i disturbi associati nel metabolismo dell'NO siano coinvolti nello sviluppo della lesione cerebrale secondaria dopo SAH, ma il ruolo esatto di questi meccanismi rimane incompletamente compreso. Mentre alcuni autori ritengono che la disfunzione di NOS e una conseguente bassa biodisponibilità di NO sia una causa importante di lesione cerebrale secondaria (e un meccanismo chiave alla base della MDD), altri sostengono che una sovrapproduzione di NO mediata da iNOS sia una risposta disadattativa che porta a lesioni tissutali aggravate a causa di stress nitrosativo.

Lo scambio transcerebrale (cioè da arterioso a venoso giugulare) di metaboliti NO e la sua interrelazione con lo stress ossidativo non è mai stato studiato nei pazienti con SAH. I ricercatori ipotizzano che la SAH sia associata a un'iniziale riduzione della biodisponibilità cerebrovascolare di NO dovuta allo scavenging da parte dei radicali liberi. Ciò potrebbe contribuire a un circolo vizioso, in cui un conseguente aumento della resistenza microvascolare, ipoperfusione cerebrale e ipossia del tessuto cerebrale aumenta ulteriormente la produzione di radicali liberi e la deplezione di NO, portando infine a lesioni cerebrali ischemiche e scarso esito.

IPOTESI:

Il presente studio esplorativo caratterizzerà lo scambio transcerebrale di marcatori di stress ossidativo/nitrosativo e metaboliti NO durante la fase iniziale dopo SAH rispetto a volontari sani. Inoltre, esaminerà l'influenza di questi disturbi sugli indici di ischemia cerebrale e disfunzione metabolica valutati dal neuromonitoraggio multimodale e l'influenza dei cambiamenti indotti nella tensione arteriosa dell'ossigeno (PaO2). Gli inquirenti ipotizzano che:

1. I pazienti avranno un maggiore efflusso cerebrale di marcatori di stress ossidativo/nitrosativo e una minore biodisponibilità cerebrovascolare di NO rispetto ai controlli sani.
2. I pazienti con SAH mostreranno una progressiva diminuzione del rilascio transcerebrale di marcatori di stress ossidativo/nitrosativo e un corrispondente aumento della biodisponibilità cerebrovascolare di NO nei giorni successivi all'ictus.
3. Una maggiore gravità clinica di SAH sarà associata a un maggiore rilascio transcerebrale di marcatori di stress ossidativo/nitrosativo ea una minore biodisponibilità cerebrovascolare di NO.
4. Una minore tensione di ossigeno nel tessuto cerebrale (PbtO2) e un carico maggiore di ipossia nel tessuto cerebrale (definita come la percentuale del tempo di monitoraggio con un PbtO2 <20 mmHg) saranno associati a un maggiore efflusso cerebrale di marcatori di stress ossidativo/nitrosativo e a una minore biodisponibilità cerebrale di n.
5. Un maggior rapporto lattato/piruvato del microdializzato e un carico maggiore di crisi metaboliche cerebrali (definite come la percentuale di tempo di monitoraggio con un rapporto lattato/piruvato >40 e una concentrazione di glucosio <0,7 mmol/l) saranno associati a un maggiore efflusso cerebrale di marcatori di stress ossidativo/nitrosativo e una minore biodisponibilità cerebrale di NO.
6. L'ipossia lieve indotta sarà associata a un aumento del rilascio transcerebrale di marcatori di stress ossidativo/nitrosativo e una riduzione della biodisponibilità cerebrovascolare di NO rispetto al basale, mentre l'iperossia lieve indotta avrà l'effetto opposto.

A scopo esplorativo, campioneremo anche il liquido cerebrospinale (CSF) in pazienti con drenaggio ventricolare esterno ed eccesso di microdializzato cerebrale quando questo sarà disponibile.

METODI:

Lo studio è uno studio fisiologico prospettico che includerà pazienti con SAH ricoverati presso l'unità di terapia neurointensiva (NICU) presso Rigshospitalet. L'inclusione dei pazienti continuerà fino a quando non avremo ottenuto dati completi su 20 pazienti nel sottostudio interventistico (vedi sotto), o fino al 1 aprile 2024, a quel punto l'inclusione sarà interrotta e i dati saranno analizzati indipendentemente dal numero di pazienti inclusi . Inoltre, 12 soggetti sani saranno inclusi come gruppo di controllo.

Conduzione pratica dello studio, pazienti:

Ai pazienti verrà inserito un catetere arterioso poco dopo il ricovero come parte delle cure di routine. Inoltre, il prima possibile dopo che l'aneurisma è stato fissato, verrà inserito un catetere venoso giugulare interno retrogrado (catetere RJV) per il prelievo di sangue venoso cerebrale. I parametri vitali saranno monitorati secondo la pratica standard in terapia intensiva neonatale e i pazienti saranno sottoposti a neuromonitoraggio multimodale continuo della pressione intracranica (ICP), PbtO2 e metabolismo cerebrale (microdialisi cerebrale). Durante gli interventi, verrà utilizzato l'ecografia Doppler transcranica (TCD) per determinare la velocità media del flusso dell'arteria cerebrale media come misura surrogata del flusso sanguigno cerebrale. Lo studio consisterà in un sottostudio osservazionale e uno interventistico, descritti singolarmente di seguito.

Sottostudio osservazionale: verranno prelevati campioni di sangue accoppiati (ovvero campioni di sangue simultanei da RJV e cateteri arteriosi) 1) immediatamente dopo il posizionamento del catetere RJV (previsto: giorno 0-2 dopo il ricovero), 2) durante gli interventi (vedi sotto) e 3) poco prima della rimozione del catetere RJV (previsto: 3-6 giorni dopo il ricovero). Oltre al prelievo di sangue, i pazienti con un drenaggio ventricolare esterno esistente verranno sottoposti a campionamento del CSF e i pazienti con un catetere per microdialisi cerebrale verranno sottoposti a campionamento del microdializzato in eccesso a fini esplorativi.

Sottostudio interventistico: l'ipo- e l'iperossia lieve saranno indotte in un ordine randomizzato modificando le impostazioni del ventilatore (la frazione di ossigeno inspirato), mirando a una PaO2 di 9-10 kPa per l'ipossia lieve e 13-14 kPa per l'iperossia lieve (standard target di trattamento: 10-12 kPa). I campioni di sangue verranno prelevati al basale (normossia) e dopo 60 minuti di ogni intervento (3 campioni di sangue accoppiati in totale).

Conduzione pratica dello studio, controlli sani:

Gli esperimenti su soggetti sani saranno condotti in terapia intensiva neonatale. La strumentazione e il monitoraggio sono simili a quanto descritto sopra: verrà inserito un catetere arterioso e RJV e i soggetti saranno sottoposti a monitoraggio TCD come indice del flusso sanguigno cerebrale oltre al monitoraggio cardiorespiratorio standard.

Dopo la strumentazione e un breve periodo di riposo, verrà condotta una valutazione di base, dopo la quale i soggetti saranno sottoposti a interventi in ordine randomizzato: l'ipo- e l'iperossia saranno indotte utilizzando una maschera aderente collegata a una valvola di non respirazione, un terminale monitor di CO2 di marea e un serbatoio alimentato tramite bombole di gas compresso. La frazione di ossigeno inspirato sarà titolata, mirando a una PaO2 di 9-10 kPa per lieve ipossia e 13-14 kPa per lieve iperossia. Inoltre, i soggetti sani saranno sottoposti a un terzo intervento in cui la frazione di ossigeno inspirato sarà aumentata a 100%. L'isocapnia sarà assicurata aggiungendo CO2 all'aria inspirata ad hoc. I campioni di sangue verranno prelevati al basale (normossia) e dopo 60 minuti di lieve ipossia, 60 minuti di lieve iperossia e 60 minuti di "grave iperossia".

ANALISI BIOCHIMICHE:

Ad ogni momento del campionamento, una piccola quantità di sangue verrà immediatamente analizzata per i livelli di gas ematici e lo stato acido-base. I rimanenti campioni biologici saranno centrifugati, aliquotati e conservati a -80°C fino all'analisi.

I campioni di sangue saranno analizzati per i seguenti marcatori di stress ossidativo: il radicale ascorbato, gli idroperossidi lipidici, la mieloperossidasi e gli antiossidanti glutatione, α/γ-tocoferolo, α/β-carotene, retinolo e licopene.

Saranno determinati i seguenti metaboliti di NO: concentrazione plasmatica totale di NO (nitrato (NO3-) + nitrito (NO2-) + S-nitrosotioli (RSNO)) e NO totale legato ai globuli rossi (nitrito (NO2-) + nitrosilemoglobina (HbNO ) + S-nitrosoemoglobina (HbSNO)). Inoltre, la 3-nitrotirosina sarà determinata come marcatore surrogato del perossinitrito.

Saranno determinati i seguenti biomarcatori di lesione dell'unità neurovascolare: S100ß, proteina acida fibrillare gliale, enolasi neurone-specifica, ubiquitina carbossi-terminale idrolasi L1, catena leggera del neurofilamento e tau totale.