Comprensione del MOA di Ozanimod tramite citometria di massa nella colite ulcerosa

Progettazione/metodologia dello studio:

Diversi gastroenterologi del nostro centro hanno accettato di assistere nella raccolta di biopsie presso i nostri ospedali: UCSD: Singh, Boland, Patel, VA: Rivera-Nieves). Anche il dottor Brian Behm, che si prende cura della maggior parte dei pazienti con IBD presso l'Università della Virginia, ha accettato di assistere nella raccolta di biopsie/PBMC.

Durante due visite (T0, T24-32) raccoglieremo biopsie, endoscopie, istologia, campioni fecali e di sangue (Tabella 1), prospetticamente da un totale di 10 pazienti con CU programmati per colonscopia (prima della terapia con ozanimod e a 24-32 settimane post trattamento). Una dimensione del campione di 10 pazienti per condizione dovrebbe essere sufficiente per ottenere differenze significative utilizzando CITRUS, in base alle determinazioni della dimensione del campione richieste (vedere di seguito).

Gli effetti del farmaco sui sottoinsiemi cellulari saranno valutati confrontando i due punti temporali (24-32 settimane dopo la terapia) con il suo controllo pretrattamento (T0). Confronteremo inoltre i risultati della citometria di massa con i parametri clinici raccolti presso il nostro centro IBD durante ogni visita (Tabella 1). I campioni clinici e i parametri dei pazienti reclutati presso l'UVA verranno inviati deidentificati tramite una casella di posta sicura gestita dall'UVA.

Raccolta, conservazione, test e analisi dei campioni

1. Dopo il posizionamento IV per la sedazione cosciente, 10 ml di sangue verranno prelevati su provette contenenti EDTA e inviati al laboratorio su ghiaccio per ulteriori elaborazioni. Il trasporto dei campioni è fornito dal personale del Centro per la ricerca traslazionale dell'UCSD (CTRI). All'arrivo nel laboratorio umido, il sangue viene centrifugato, il plasma separato e i leucociti isolati mediante centrifugazione in gradiente. I mezzi di crioconservazione vengono aggiunti alla frazione leucocitaria. Plasma e leucociti vengono conservati a -80 C.
2. Biopsie standard saranno ottenute anche dall'ileo (effetto di controllo del farmaco sul segmento non coinvolto), nonché dai segmenti del colon coinvolti e non coinvolti e saranno sospese in terreni completi per l'isolamento cellulare. Il trasporto dei campioni è fornito dal personale del Centro per la ricerca traslazionale dell'UCSD. All'arrivo nel laboratorio umido, i mezzi di crioconservazione vengono aggiunti alle biopsie e conservati a -80 C.

Abbiamo riscontrato variazioni significative tra lotto e lotto durante gli studi pilota, anche controllate utilizzando veri-cells. Per questo motivo, al completamento della raccolta, tutte le elaborazioni e le acquisizioni di cellule/tessuti sul citometro verranno eseguite insieme.

Non verranno condotte visite specifiche per lo studio per i pazienti con IBD. Tutte le visite e le acquisizioni di campioni saranno effettuate secondo le visite standard di cura. Per questo studio non verranno eseguiti interventi di ricerca specifici relativi al trattamento sui pazienti con IBD. Pertanto classifichiamo lo studio come non interventistico.

Analisi dei dati:

Analizziamo i dati CyTOF ormai da diversi anni, come illustrato nei due manoscritti pubblicati da Tyler et al.. Inoltre abbiamo lavorato con Amir El-Ad che gestisce la piattaforma AstoLabe per analisi di citometria ad alta dimensione. Per esaminare le differenze nell'abbondanza della popolazione e nell'espressione specifica dei marcatori cellulari, abbiamo identificato CITRUS come uno dei tanti algoritmi appropriati per eseguire la nostra analisi delle biopsie IBD. CITRUS identifica cluster di cellule fenotipicamente simili in modo non supervisionato, caratterizza il comportamento dei cluster identificati utilizzando metriche interpretabili biologicamente e sfrutta algoritmi di apprendimento supervisionato regolarizzato per identificare cluster di sottoinsiemi il cui comportamento è predittivo dell'endpoint dei campioni. CITRUS incoraggia fortemente l'uso di un minimo di 8 campioni per gruppo. Pertanto, per il nostro progetto attuale, otterremo un minimo di 10 campioni per la colite ulcerosa prima e dopo la terapia con ozanimod. Secondo le stime, basate sui nostri dati preliminari, questa dimensione del campione sarà sufficiente per identificare con precisione anche popolazioni rare e per determinare cambiamenti nell'abbondanza tra sottoinsiemi di cellule. È abbastanza sensibile da valutare l'espressione differenziale di qualsiasi marcatore in un'analisi a tre vie. Verranno eseguiti confronti bioinformatici tra i sottoinsiemi cellulari presenti nell'ileo, nel colon e nelle PBMC ai tempi 0 e 24-32 settimane per ciascun paziente per l'endpoint principale di valutare l'effetto del farmaco sui sottoinsiemi cellulari rilevanti.

Più recentemente, tutti i nostri dati sono archiviati nella piattaforma Omiq, che fornisce molteplici algoritmi per l'analisi dei dati.

Per l'associazione invariabile di variabili indipendenti continue con la risposta, verrà utilizzato il t-test per dati non appaiati o il test di Wilcoxon a due campioni, mentre per le variabili categoriali verrà utilizzato il test esatto di Fisher. Tutti i confronti saranno bilaterali ed eseguiti al livello di significatività 0,05. Poiché queste analisi sono esplorative, non verrà apportato alcun aggiustamento per confronti multipli.

Piano di gestione dei dati: tutti i dati verranno archiviati su computer protetti da password presso l'UCSD. Tutti i file fisici e i dati grezzi saranno archiviati in armadietti chiusi nel campus dell'UCSD all'interno del laboratorio di Jesus Rivera-Nieves. Ai pazienti verranno forniti identificatori dello studio come parte della Biobanca IBD e non verrà utilizzato alcun identificatore personale. Il piano di gestione dei dati seguirà quello della biobanca IBD dell'UCSD che è stato ampiamente esaminato dall'IRB e dal Comitato per la protezione dei soggetti umani dell'UCSD.

All'UVA, i dati verranno raccolti dal coordinatore locale dello studio e deidentificati. Tutti i dati verranno inviati elettronicamente utilizzando una casella di posta sicura. Questo è stato approvato dall'UVA IRB.