Comprensión del MOA de Ozanimod mediante citometría masiva en la colitis ulcerosa

Diseño/Metodología del estudio:

Varios gastroenterólogos de nuestro centro han aceptado ayudar con la recolección de biopsias en nuestros hospitales: UCSD: Singh, Boland, Patel, VA: Rivera-Nieves). El Dr. Brian Behm, que atiende a la mayoría de los pacientes con EII en la Universidad de Virginia, también aceptó ayudar con la biopsia/recolección de PBMC.

Durante dos visitas (T0, T24-32) recolectaremos biopsias, endoscopias, histología, muestras fecales y de sangre (Tabla 1), de forma prospectiva de un total de 10 pacientes con CU programados para colonoscopia (antes del tratamiento con ozanimod y a las 24-32 semanas). postoperatorio). Un tamaño de muestra de 10 pacientes por afección debería ser suficiente para lograr diferencias significativas utilizando CITRUS, según las determinaciones del tamaño de muestra requeridas (ver más abajo).

Los efectos del fármaco en los subconjuntos celulares se evaluarán comparando los dos puntos temporales (24 a 32 semanas después de la terapia) con su control previo al tratamiento (T0). Además, compararemos los resultados de la citometría de masas con los parámetros clínicos que se recopilan en nuestro centro de EII durante cada visita (Tabla 1). Las muestras clínicas y los parámetros de los pacientes reclutados en la UVA se enviarán sin identificación a través de un buzón seguro administrado por la UVA.

Recolección, almacenamiento, pruebas y análisis de muestras.

1. Después de la colocación de una vía intravenosa para sedación consciente, se extraerán 10 ml de sangre en tubos que contienen EDTA y se enviarán al laboratorio en hielo para su posterior procesamiento. El transporte de muestras está a cargo del personal del Centro de Investigación Traslacional (CTRI) de UCSD. Al llegar al laboratorio húmedo, la sangre se centrifuga, se separa el plasma y se aíslan los leucocitos mediante centrifugación en gradiente. Se añaden medios de criopreservación a la fracción de leucocitos. El plasma y los leucocitos se almacenan a -80 C.
2. También se obtendrán biopsias estándar del íleon (efecto de control del fármaco en el segmento no afectado), así como en segmentos del colon involucrados y no involucrados y se suspenderán en medio completo para el aislamiento celular. El transporte de muestras está a cargo del personal del Centro de Investigación Traslacional de UCSD. Al llegar al laboratorio húmedo, se agregan medios de criopreservación a las biopsias y se almacenan a -80 C.

Hemos encontrado variaciones significativas entre lotes durante los estudios piloto, incluso controladas mediante veri-cells. Por ese motivo, todo el procesamiento y adquisición de células/tejidos en el citómetro se realizarán todos juntos, una vez finalizada la recolección.

No se realizarán visitas específicas del estudio para pacientes con EII. Todas las visitas y adquisiciones de muestras se realizarán en visitas de atención estándar. Para este estudio no se realizarán intervenciones de investigación relacionadas con tratamientos específicos en pacientes con EII. Por lo tanto, categorizamos el estudio como no intervencionista.

Análisis de los datos:

Hemos estado analizando datos de CyTOF durante varios años, como se ilustra en los dos manuscritos publicados por Tyler et al. Además, hemos trabajado con Amir El-Ad, que dirige la plataforma AstoLabe para análisis de citometría de alta dimensión. Para examinar las diferencias en la abundancia de la población y la expresión de marcadores celulares específicos, hemos identificado a CITRUS como uno de los muchos algoritmos apropiados para realizar nuestro análisis de biopsias de EII. CITRUS identifica grupos de células fenotípicamente similares de manera no supervisada, caracteriza el comportamiento de los grupos identificados utilizando métricas biológicamente interpretables y aprovecha algoritmos de aprendizaje supervisados ​​regularizados para identificar subconjuntos de grupos cuyo comportamiento predice el criterio de valoración de las muestras. CITRUS recomienda encarecidamente el uso de un mínimo de 8 muestras por grupo. Por tanto, para nuestro proyecto actual, obtendremos un mínimo de 10 muestras de CU antes y después de la terapia con ozanimod. Según las estimaciones, según nuestros datos preliminares, este tamaño de muestra será suficiente para identificar con precisión incluso poblaciones raras y determinar cambios en la abundancia entre subconjuntos de células. Es lo suficientemente sensible como para evaluar la expresión diferencial de cualquier marcador en un análisis de tres vías. Comparaciones bioinformáticas entre los subconjuntos de células presentes en íleon, colon y PBMC en los momentos 0 y 24-32 semanas para cada paciente se realizarán como criterio de valoración principal de evaluar el efecto del fármaco en subconjuntos de células relevantes.

Más recientemente, todos nuestros datos se almacenan en la plataforma Omiq, que proporciona múltiples algoritmos para el análisis de datos.

Para la asociación univariable de variables independientes continuas con respuesta, se utilizará una prueba t no apareada o una prueba de dos muestras de Wilcoxon, mientras que para las variables categóricas se utilizará la prueba exacta de Fisher. Todas las comparaciones serán bilaterales y se realizarán con un nivel de significancia de 0,05. Como estos análisis son exploratorios, no se realizarán ajustes para comparaciones múltiples.

Plan de gestión de datos: Todos los datos se almacenarán en computadoras protegidas con contraseña en UCSD. Todos los archivos duros y los datos sin procesar se almacenarán en gabinetes cerrados con llave en el campus de UCSD dentro del laboratorio de Jesús Rivera-Nieves. Los pacientes recibirán identificadores del estudio como parte del Biobanco de EII y no se utilizarán identificadores personales. El plan de gestión de datos seguirá el del Biobanco IBD de UCSD, que ha sido revisado exhaustivamente por el IRB y el Comité para la Protección de Sujetos Humanos de UCSD.

En la UVA, los datos serán recopilados por el coordinador del estudio local y anónimos. Todos los datos se enviarán electrónicamente mediante un buzón de correo seguro. Esto ha sido aprobado por el IRB de la UVA.