トロンビン生成アッセイの標準プロトコルの評価

主な目標 目的は、精巧な標準化プロトコルを使用することで、TGA-CAT (トロンビン生成アッセイ較正自動トロンボグラム) メソッドのラボ間変動をさらに改善し、拡張して大規模な前向き多施設研究を現実のものにすることです。

プロジェクトの目標は次のとおりです。

• 強化された標準化された TGA-CAT プロトコルを評価することにより、ラボ間の変動性を判断します。
• 重度の血友病 A 患者に組み換え FVIII 製品（Advate）を投与することによって、TGA-CAT 法の検査室間変動が影響を受けるかどうかを評価すること
• 重度の血友病 A 患者に長時間作用型 FVIII 製品 (アディノベート) を投与することによって、TGA-CAT 法の検査室間変動が影響を受けるかどうかを評価すること
• 3 つの参照血漿の能力を評価し、データを正規化して、ラボ間のばらつきを改善します。

はじめに TGA CAT 法は、出血性疾患の診断と管理 (1、2)、凝固亢進の検出 (3、4)、経口抗凝固薬のモニタリングと特徴付け (5、6) など、複数の目的に有用であることが証明されています。 これらの研究のほとんどは単一施設での研究であり、結果をさらに検証するには大規模な前向き多施設研究が必要です。 これらの多施設研究は、方法が標準化されていないため作成が難しいことが証明されています。 ここ数年、TGA-CAT メソッドのラボ間でのばらつきが大きいという問題に対処する記事がいくつかあり、徹底的に練り上げられた標準化プロトコルが提示されています。 メソッド自体とその分析前の要因、および結果の正規化のための参照血漿 (RP) の使用の両方に焦点が当てられています。 ある記事では、結果の正規化に RP を選択すると、ラボ間の変動性が大幅に減少し、特定の RP の方がその能力が優れていることが示されました (7)。

最近、半減期が延長された多数の組み換え第 VIII 因子 (rFVIII) および第 IX 因子 (rFIX) 薬が開発され、市場に出ようとしているか、市場に出ています。 薬物の持続的な活性の長さは患者によって異なり、患者の薬物投与を個別に調整する必要があることは明らかです。 トロンビン生成は、最適な薬物投与を調整し、各個人の薬物の効果を監視する優れたツールであることが証明される可能性があります.

方法および材料 トロンビンの生成 トロンビンの生成は、Hemker et al.(8): 校正済み自動トロンボグラム (CAT、Thrombinoscope BV、マーストリヒト、オランダ) によって記述された方法に従って測定されます。

試薬 PPP 試薬 LOW (1 pM)、PPP 試薬 (5 pM)、トロンビン キャリブレーター、FluCa キット (TS31.00、 TS30.00、 TS20.00 と TS50.00、 Thrombinoscope BV、マーストリヒト、オランダ) がテストに使用されます。

サンプル 正常血漿、低凝固性および高凝固性血漿の 3 種類の血漿をテストします。 正常および高凝固性血漿は3人のドナーからプールされ、低凝固性血漿は4人のドナーから収集されます。 マルメ凝固ユニットで定期的に治療を受けている 5 人の血友病 A (HA) 患者から、4.5 mL チューブのクエン酸血液を一度に 10 本採取して低凝固性血漿を採取します。 正常な血漿は、同じユニットの 3 人の同僚から収集され、各人は 4.5 mL のクエン酸添加血液の 13 本のチューブを提供します。 凝固亢進性血漿は、4.5mLのクエン酸血液の13本のチューブを採取することにより、TGA CATパラメーター値が中央値の2 SDを超えることが示されている3人の健康なボランティアから調製されます。 ＦＶＩＩＩ濃縮物、Ａｄｖａｔｅ（商標）、それぞれ長時間作用型のＡｄｙｎｏｖａｔｅ（商標）を別々の機会に２回投与された重度のＨＡ患者の１人の患者からの血漿も試験される。 インフォームド コンセントの後、患者は 72 時間は通常の予防投与を行わないように求められます。 患者には、Advate™ と Adynovate™ がそれぞれ 30 U/kg で投与されます。 モニタリングサンプルは、注射後１時間、８時間、２４時間、３６時間および４８時間（アドベイト（Ａｄｖａｔｅ）（商標））および１時間、２４時間、３６時間、４８時間および７２時間（アディノベイト（Ａｄｙｎｏｖａｔｅ）（商標））で採取される。 各時点で、4.5 mL の血液のチューブ 3 本を採取します。

参照血漿 Siemens Control Plasma P 希釈 1:5 は低凝固性 RP として使用され、HemosIL キャリブレーション血漿 (Instrumentation Laboratory、ベッドフォード、マサチューセッツ州、米国) は標準 RP および高凝固性血漿 PS-DP (プロテイン S 欠乏血漿) として使用されます。 (酵素研究所、South Bend、In、USA) が使用されます。

統計分析生データは、マルメのスコーネ大学病院の凝固ユニットで収集および分析されます。 各参加センターは、ブランド-アルトマン バイアス プロットが使用される一致のテストで、マルメ凝固ユニットと照合されます。 平均、標準偏差 (SD)、および変動係数 (CV%) は、正規化の有無にかかわらず各センターについて計算され、表に表示されます。 アドベイト/アディノベイト除去プロファイルがプロットされ、平行曲線の一般的なテストを含む分散の多変量反復測定分析が適用され、除去プロファイルのセンター間の差異が評価されます。

研究デザイン この研究の目的は、高度に標準化されたプロトコルを使用して TGA-CAT を実行した TGT の研究所間の変動性、データの正規化のための RF の使用が結果の変動性にどのように影響するかを評価し、長期間のモニタリングにおける TGA-CAT の有用性を評価することです。 FVIII 薬物投与。 参加センターのすべての蛍光光度計を修理し、研究開始前に温度を 37 C に調整する必要があります。 最新のソフトウェア バージョンがインストールされている必要があります (トロンボスコープ BV、マーストリヒト、オランダ、バージョン V5.0.0.742)。 すべての実験装置、ピペット、水浴、浄水器などは、校正する必要があります。 研究に必要なすべての血漿、TGA-CAT試薬は、マルメの凝固ユニットによってすべての参加センターに投与および配布されます。 サンプルと試薬と一緒に、プレートセットアップスキームファイルと重要な分析前および分析ステップをカバーするビデオファイルを含む USB メモリスティックも提供されます。 3 つのプールされた血漿 (正常、低凝固性および高凝固性)、3 つの RF、5 つの Adynovate および 5 つの Advate モニタリング サンプルが、USB メモリ スティックで提供されるスキームに従って、各参加センターによって 5 つの異なる日に 5 回実行されます。トリガー、PPP 試薬 LOW (1 pM) および PPP 試薬 (5 pM)。 RF と試薬の使用を最大化するために、毎日 2 回のテスト実行が予定されています。 3 つの異なるタイプの RF をテストする理由は、初期の研究結果が、たとえば低凝固性 RF を低凝固性プラズマに使用した場合に、変動性がより適切に減少することを示唆していたという事実です (9)。