Evaluación de un protocolo estandarizado para el ensayo de generación de trombina

Objetivo principal El objetivo es mejorar aún más la variabilidad entre laboratorios para el método TGA-CAT (trombograma automatizado calibrado por ensayo de generación de trombina) mediante el uso de un protocolo de estandarización elaborado y, por extensión, haciendo realidad el uso de grandes estudios prospectivos multicéntricos.

Los objetivos del proyecto son:

• Determinar la variabilidad entre laboratorios mediante la evaluación de un protocolo TGA-CAT estandarizado mejorado.
• Evaluar si la variabilidad entre laboratorios del método TGA-CAT se ve afectada por la administración de un producto de FVIII recombinante (Advate) en una persona con hemofilia A grave
• Evaluar si la variabilidad entre laboratorios del método TGA-CAT se ve afectada por la administración de un producto de FVIII de acción prolongada (Adynovate) en una persona con hemofilia A grave
• Evaluar la capacidad de tres plasmas de referencia, mediante la normalización de datos, para mejorar la variabilidad entre laboratorios.

Introducción El método TGA CAT ha demostrado su utilidad para múltiples propósitos, incluido el diagnóstico y manejo de trastornos hemorrágicos (1, 2), detección de hipercoagulabilidad (3, 4) y seguimiento y caracterización de fármacos anticoagulantes orales (5, 6). La mayoría de estos estudios son estudios de un solo centro y se necesitan grandes estudios prospectivos multicéntricos para validar aún más los resultados. Estos estudios multicéntricos han demostrado ser difíciles de producir debido a la falta de estandarización del método. En los últimos años, varios artículos han abordado el problema de la gran variabilidad entre laboratorios para el método TGA-CAT al presentar protocolos de estandarización elaborados minuciosamente. La atención se ha centrado tanto en el método en sí mismo y sus factores preanalíticos como en el uso de plasmas de referencia (RP) para la normalización de los resultados. Un artículo mostró que la elección de PR para la normalización de resultados podría reducir en gran medida la variabilidad entre laboratorios y que ciertos PR tienen una mejor capacidad para hacerlo (7).

Últimamente se han desarrollado una serie de fármacos de factor VIII recombinante (rFVIII) y IX (rFIX) con vida media prolongada y están a punto de llegar al mercado o ya lo han hecho. La duración de la actividad prolongada del fármaco difiere entre los pacientes y es obvia la necesidad de adaptar la administración del fármaco al paciente. La generación de trombina podría resultar una excelente herramienta para adaptar la administración óptima del fármaco y controlar el efecto del fármaco para cada individuo.

Métodos y materiales Generación de trombina La generación de trombina se medirá según el método descrito por Hemker et al.(8): trombograma automatizado calibrado (CAT, Thrombinoscope BV, Maastricht, Países Bajos).

Reactivos Reactivo PPP BAJO (1 pM), reactivo PPP (5 pM), Calibrador de trombina y kit FluCa (TS31.00, TS30.00, TS20.00 y TS50.00, Thrombinoscope BV, Maastricht, Países Bajos) se utilizará en la prueba.

Muestras Se analizarán tres plasmas diferentes, plasma normal, plasma hipocoagulable e hipercoagulable. El plasma normal e hipercoagulable se combinará de 3 donantes y el plasma hipocoagulable se recolectará de 4 donantes. Se recolectará plasma hipocoagulable de cinco pacientes con hemofilia A (HA) tratados regularmente en la Unidad de Coagulación de Malmö tomando 10 tubos de 4,5 ml de sangre citratada en una sola ocasión. Se recolectará plasma normal de 3 compañeros de trabajo en la misma unidad, donando cada persona 13 tubos de 4.5 mL de sangre citratada. Se preparará plasma hipercoagulable a partir de 3 voluntarios sanos, que demuestren tener valores de parámetros TGA CAT > 2 SD de la mediana mediante la toma de 13 tubos de 4,5 ml de sangre citratada. También se analizará el plasma de un paciente con HA grave que recibió concentrados de FVIII, Advate™ o Adynovate™ de acción prolongada en dos ocasiones distintas. Después del consentimiento informado, se le pedirá al paciente que no tome su dosis habitual de profilaxis durante 72 horas. El paciente recibirá Advate™ y Adynovate™ respectivamente a 30 U/kg. Las muestras de seguimiento se tomarán 1h, 8h, 24h, 36h y 48h (Advate™) y 1h, 24h, 36h, 48h y 72h (Adynovate™) después de la inyección. En cada punto de tiempo se tomarán 3 tubos de 4,5 ml de sangre.

Los plasmas de referencia Siemens Control Plasma P diluido 1:5 se utilizarán como PR hipocoagulable, el plasma de calibración HemosIL (Instrumentation Laboratory, Bedford, Ma, EE. UU.) se utilizará como PR estándar y como plasma hipercoagable PS-DP (plasma con deficiencia de proteína S) (Laboratorios de investigación de enzimas, South Bend, In, EE. UU.).

Análisis estadístico Los datos sin procesar se recopilarán y analizarán en la Unidad de Coagulación del Hospital Universitario de Skåne, Malmö. Cada centro participante se emparejará con la unidad de coagulación de Malmö en una prueba de concordancia en la que se utilizará el gráfico de sesgo de Bland-Altman. La media, la desviación estándar (SD) y el coeficiente de variación (CV%) se calcularán para cada centro con y sin normalización y se mostrarán en una tabla. Se trazarán los perfiles de eliminación de Advate/Adynovate y se aplicarán análisis de varianza de mediciones repetidas multivariadas, incluida una prueba general para curvas paralelas, para evaluar las diferencias entre los Centros en los perfiles de eliminación.

Diseño del estudio El estudio tiene como objetivo evaluar la variabilidad interlaboratorio de TGA-CAT realizado TGT con un protocolo altamente estandarizado, cómo el uso de RF para la normalización de datos impacta en la variabilidad de los resultados y evaluar la utilidad de TGA-CAT en el seguimiento prolongado Administración de fármacos FVIII. Todos los fluorómetros de los centros participantes deben ser reparados y tener la temperatura calibrada a 37 C antes del inicio del estudio. Debe estar instalada la última versión del software (Thromboscope BV, Maastricht, Países Bajos, versión V5.0.0.742). Todo el equipo de laboratorio, pipetas, baños de agua, purificadores de agua, etc., necesita ser calibrado. Todos los plasmas, reactivos TGA-CAT necesarios para el estudio serán administrados y distribuidos a todos los centros participantes por la Unidad de Coagulación de Malmö. Junto con las muestras y los reactivos, también se proporcionará una memoria USB que contiene un archivo del esquema de configuración de la placa y un archivo de video que cubre los pasos analíticos y preanalíticos críticos. Cada centro participante analizará tres plasmas agrupados (normal, hipocoagulable e hipercoagulable), tres RF, cinco Adynovate y cinco Advate cinco veces en cinco días diferentes, siguiendo un esquema provisto en la memoria USB, con dos muestras diferentes. activadores, reactivo PPP BAJO (1 p. m.) y reactivo PPP (5 p. m.). Se programan dos ejecuciones de prueba cada día para maximizar el uso de RF y reactivos. La razón para probar tres tipos diferentes de RF es el hecho de que los resultados de un estudio anterior implicaron una mejor reducción de la variabilidad al usar, por ejemplo, un RF hipocoagulable a plasmas hipocoagulables (9).