卵巣胚細胞腫瘍におけるタンパク質P16発現の免疫組織化学的評価。

この研究では、次のことを目指しています。

1-良性および悪性OGCTの腫瘍性成分におけるp16の免疫組織化学的発現を評価し、その免疫反応性を記録します。

2- MOGCT における P16 免疫組織化学的発現と Ki 67 増殖指数および FIGO 病期分類との相関。

1. 研究のタイプ: 一致したケースコントロール研究。

2. 研究対象:

   1. 包含基準: 良性 (成熟嚢胞性奇形腫) および悪性腫瘍 (未熟胚細胞腫、未熟奇形腫および卵黄嚢腫瘍) を含むさまざまなタイプの卵巣胚細胞腫瘍。

   2. 除外基準:

      -卵巣胚細胞腫瘍以外の切除された卵巣腫瘍などの選択基準を満たさない基準、例えば、上皮性卵巣腫瘍、性索間質腫瘍または転移性卵巣病変。

      • 研究プロトコルは、2019年12月にアシュート大学医学部の治験審査委員会によって承認され（IRB No.17100871）、この研究の倫理的承認は、アシュート大学医学部の医療倫理委員会から得られました。
      • 研究環境: アシュート大学医学部病理学科の IHC 研究室。
      • 組織サンプリング: 2010 年 1 月から 2021 年 1 月までに、アシュート大学病院 (AUH) および南エジプト癌研究所 (SECI) の外科病理学部門から、ホルマリン固定、パラフィン ワックス包埋卵巣標本 62 個を取得しました。 これらの標本には以下が含まれます。

      (グループ A) 22 の悪性卵巣胚細胞腫瘍 (MOGCT)、(グループ B) 20 の見かけの正常な卵巣組織を対照群として、(グループ C) 20 の成熟した嚢胞性奇形腫を同等の良性の比較群として。

      グループ A は、5 つの未熟胚細胞腫、8 つの未熟奇形腫 (そのうちの 4 つがグレード II、他の 4 つがグレード III、FIGO グレーディング システム)、および 9 つの卵黄嚢腫瘍を構成します。 患者の年齢は 12 ～ 23 歳 (中央値 16.5 歳) でした。 各 MOGCT の初期診断は、WHO の卵巣腫瘍分類に従って再評価されました。

      グループ B には、非卵巣性、非悪性原因の多発性子宮筋腫および対照群としての腺筋症に対する腹式子宮全摘出術および卵管卵巣摘出術の標本とともに外科的に切除された、通常明らかな卵巣が含まれます。 患者の年齢は 42 ～ 64 歳 (中央値 50 歳) でした。

      利用可能なすべてのヘマトキシリンおよびエオシン染色スライドは、2 人の独立した病理学者によって定期的な光学顕微鏡によって検査され、最も代表的な 1 つまたは 2 つの組織ブロックが免疫組織化学染色に使用されました。 臨床的および病理学的データには、病理学的報告に従って評価された病変の年齢、グレード、病期、再発が含まれます。

      • 免疫組織化学: 組織サンプルは、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織ブロックで、室温で保存されました。 選択した代表的な組織ブロックから厚さ 4 um の薄切片を切り取り、コーティングしたスライドに乗せ、70℃のオーブンで 25 分間保持し、キシレンの 2 つの容器でそれぞれ 15 分間洗浄して脱パラフィンし、アルコールの連続希釈 (100%、90%、80%、70%) で、各希釈で 5 分間。 次に、非特異的なバックグラウンドを防ぐために切片を 3% 過酸化水素で 10 分間処理した後、PBS バッファーで 4 回十分に洗浄しました。 抗原回復のために、スライドをクエン酸緩衝液 (PH = 6) に保持し、90℃で 15 分間オートクレーブし、室温まで放冷しました。 スライドをPBSバッファーで4回十分に洗浄し、組織切片を一次抗体とともにインキュベートしました。 p16INK4a Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody (RM267) (MA5-27905) を 1:500 に希釈して一晩、二次抗体とインキュベート。各ステップで多価ポリマー-HRP を 10 分間使用した後、十分な量の 4 回の PBS バッファー洗浄を行います。 次いで、組織をジアミノベンジジン色原体（ＤＡＰ−色原体）で１０分間褐色発色のために処理した。 次に、対比染色として Mayer ヘマトキシリンで切片を 2 分間処理しました。

      悪性症例のみから受け取った切片については、脱パフィンおよび 3% 水素ペルオキシダーゼによるブロッキング後の組織切片を一次抗体とインキュベートしたため、追加の Ki67 IHC 染色を追加します。 Ki67 抗体 (DAKO)、20 分間使用する準備ができた後、二次抗体とインキュベートします。多価ポリマー-HRPで20分間処理した後、茶色の発色のためにジアミノベンジジン色素原(DAP-色素原)で5分間処理した。 次に、対比染色として Mayer ヘマトキシリンで切片を 2 分間処理しました。

      スライドを水道水で洗浄し、アルコールの連続希釈により脱水し、キシレンで短時間洗浄し、DPXでマウントしました。

      正常な見かけの卵巣組織を対照として使用した。 ｐ１６発現をブロックする子宮頸部非角化扁平上皮癌からの切片を陽性対照として使用した。一次抗体処理なしの組織スライドをネガティブコントロールとして使用しました。

      ・免疫組織化学的評価：Ｐ１６ ＩＨＣ染色について、Ｐ１６陽性細胞のパーセンテージおよび陽性シグナル（核または細胞質）の位置を、すべての病変の新生物成分について視覚的に推定した。 ドイツの半定量的スコアリングシステムを使用してP16発現を評価しました。これは、細胞質および核の染色の強度に応じてすべての腫瘍にスコアが付けられるためです（染色なし= 0、弱い染色= 1、中程度の染色= 2、強い染色= 3 ) 染色された細胞の程度 (0% = 0、1-10% = 1、11-50% = 2、51-80% = 3、81-100% = 4)。 最終的な免疫反応性スコアは、強度スコアに染色細胞の陽性スコアの程度を掛けることによって決定されます。最小スコアは 0、最大スコアは 12 (スコア 0、1、2、3、4、6、8、 9および12）。

      悪性症例のみの KI67 IHC 染色では、検査したすべての切片の染色強度に関係なく、核陽性染色細胞の割合を評価しました (KI インデックスの推定のために切片あたり少なくとも 1000 個の腫瘍細胞をカウントしました)。

      -統計分析: IBM-SPSS バージョン 24 を使用してデータを分析しました。 数値データは平均値と標準偏差として提示され、カテゴリデータは数とパーセンテージとして提示されました。 記述統計量: 平均、標準偏差、中央値、範囲、およびパーセンテージが計算されました。 有意性の検定: 3 つ以上のカテゴリを持つ連続変数の場合。 ANOVA 検定を計算して、正規分布に従うデータの平均差を検定し、独立したサンプルのクラスカル・ウォリスを使用して、正規分布に従わないグループ間の中央値の差を比較し、事後検定をボンフェローニ補正を使用して計算しました。 相関分析を使用した (スピアマンの順位相関、両側)。

      p 値 < 0.05 は有意と見なされました。