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Covid-19患者における単球とNK細胞の活性

2020年5月3日 更新者：Ietto Giuseppe、Università degli Studi dell'Insubria

SARS-CoV-2陽性患者における免疫介在メカニズムの研究：Covid 19の影響を受けた被験者の血液中の単球およびNK細胞の表現型および機能分析

SARS-CoV-2 はベータコロナウイルス科に属し、その感染経路と症状はすべての市中感染型コロナウイルスと同じです。 新型コロナウイルスの主な違いは、致死率が約 3% と高いことです。

死亡率は 50 歳以上の患者でのみ 1% を超えていますが、40 歳までは 0.4% 未満です。 現在までに、10 歳未満の子供の死亡は報告されていません。 死亡率は、女性よりも男性の方がほぼ 2 倍です。 感染患者の年齢による死亡率のこの分布は、高齢に加えて他の併存疾患に部分的にのみ起因する可能性があります。 実際、既往症のない患者の致死率は 0.9% です。

小児および一般的に 40 歳未満の患者の重症化率がほぼゼロであることは、まったく説明のつかないことです。 幼児、子供、若者が感染する可能性がありますが、感染は急速に自然治癒するか、無症状です。 高齢の患者は、免疫応答が遅れて起こるため、重度の肺損傷を起こします。

これらの現象の考えられる説明は、ウイルス自体の新規性とは無関係に、若年層の SARS-CoV-2 への迅速な対応を保証するものである可能性があります。

若い人たちは、以前の接触なしにウイルスの抗原にすでに感作されているようです.

この免疫は実際には特異的ではありませんが、ウイルスの多くの抗原に対して「部分的に特異的」ですが、生物の感染を制限することができます. 何かが免疫系を刺激し、ますます多くの抗原に対して免疫を分散させました。 子供は、地域社会を循環するすべてのウイルスに最もさらされている年齢層です。

この免疫は永続的ではなく、徐々に消えていきます。 ゆっくりと減少するため、仮想的な刺激が発生する2歳から50歳まで保護します。

健康な人が受ける唯一の外的刺激はワクチンです。 すべての予防接種、特に破傷風、ジフテリア トキソイド、および百日咳などの不活化細菌は、免疫システムを刺激する可能性があります。 それらは特定の免疫を発達させますが、コロナウイルスや他のコミュニティを循環するウイルスのように、通過中の抗原に対する発芽免疫も生成します.

開発された免疫は、自然消滅するまで何年にもわたって複数のウイルス感染に対してある程度の保護を提供します.

50 年を過ぎると、その免疫は回復と再活性化が遅くなります。 さらに、免疫系が阻害されている移植レシピエントと HIV 感染患者は、予想外に、SARS-CoV-2 感染の最悪の合併症に苦しむようには見えません。 免疫系の不均衡は、ウイルスへの反応中に極めて重要な役割を果たし、過度の炎症の破壊的な結果を制限する可能性があります.

プロトコルが基づいている医学的仮説によると、若い人々は、エピジェネティックな再プログラミングを通じて誘導される自然免疫細胞の機能的適応、特に「バイスタンダー」によって引き起こされるコミュニティウイルスに対する既存の「部分的に特異的な」免疫から恩恵を受ける可能性があります。事前の予防接種の効果」。 この研究では、重症度の異なるSARS-CoV-2に感染した患者の間に存在する主な違いを探ります。 私たちは、それぞれが特定の免疫学的パターンを持つさまざまな患者集団を認識すると想定しています。 それは、サイトカイン、可溶性因子の血清レベル、および自然コンパートメントと後天コンパートメントの両方の免疫細胞活性の点で異なる可能性があります。 Covid-19の病因におけるこれらの免疫学的現象の役割の証拠は、治療的免疫調節治療の実施の基礎です. さらに、免疫学的リスクプロファイルの定義により、確立された治療法を各種類の患者に合わせて調整することができます。

調査の概要

状態

状態

現在の募集状況やアクセス拡大状況を示します。
わからない

条件

条件

研究されている疾患、障害、症候群、病気、またはけが。 ClinicalTrials.gov では、条件には、寿命、生活の質、健康上のリスクなど、他の健康関連の問題も含まれる場合があります。

介入・治療

介入・治療

臨床研究の焦点となるプロセスまたはアクション。介入には、医薬品、医療機器、処置、ワクチン、および治験中またはすでに利用可能なその他の製品が含まれます。介入には、教育や食事や運動の変更などの非侵襲的アプローチも含まれます。

詳細な説明

プロトコルが基づいている医学的仮説によると、若い人々は、エピジェネティックな再プログラミングを通じて誘導される自然免疫細胞の機能的適応、特に「バイスタンダー」によって引き起こされるコミュニティウイルスに対する既存の「部分的に特異的な」免疫から恩恵を受ける可能性があります。事前の予防接種の効果」。 この研究では、重症度の異なるSARS-CoV-2に感染した患者の間に存在する主な違いを探ります。 私たちは、それぞれが特定の免疫学的パターンを持つさまざまな患者集団を認識すると想定しています。 それは、サイトカイン、可溶性因子の血清レベル、および自然コンパートメントと後天コンパートメントの両方の免疫細胞活性の点で異なる可能性があります。

データは 3 つのアプローチを使用して収集されます。

  • 自然免疫応答を研究し、遺伝子プロファイルを特定するための、患者群の実験的分析。
  • 患者のワクチン接種歴を特定するための疫学的分析。
  • 免疫学的プロファイルを検出するための臨床分析;

特定の分析のために、自然免疫応答を研究し、遺伝的プロファイルを特定するために、科学者は末梢血から、両方のグループのNK細胞、単球、CD4およびCD8 T細胞を分析します：健康な患者（SARS-CoVの検査で陰性） -2) およびサブグループの病気の患者 (AS 19、PAU19、POL19、ARD19)。

患者のさまざまなグループから、血液サンプル (10 ～ 15 mL) を EDTA チューブに採取し、360 g で 10 分間遠心分離して血漿を取得し、その後の対象のサイトカインおよびケモカインの分析のために -80 °C で保存します。登録終了時のELISA（IL-1b、IL-6、TNF、IFN-α、IL-10、IL-12、CCL2およびCXCL10）による。

細胞ペレットをＰＢＳで元の容量に戻し、１：１（ｖ／ｖ）に希釈し、次いでＦｉｃｏｌｌ Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７を用いて５００ｇで３０分間密度勾配層別化する。 ホワイト リングに由来する末梢血単核細胞 (PBMC) が収集され、PBS で 2 回洗浄され、フローサイトメーター アッセイ (REFF) を使用した後続の実験に使用されます。 PBMC を使用した in vitro 培養は、ex vivo で 1 日から数日まで変化し、細胞は 10% ウシ胎児血清 (FBS)、2 mM l-グルタミン、100 U/mL ペニシリンを添加した RPMI 1640 培地で維持されます。および 100 μg/mL ストレプトマイシン (P/S)、37°C​​、5% CO2。

ex vivo 蛍光活性化セルソーター (FACS) 表現型分析を行うには、FACS チューブあたり 2.5x105 の新鮮な全 PBMC を、次のようなモノクローナル抗体 (mAb) で 4°C で 30 分間染色します: CD3-PerCP、CD56-APC 、CD16-FITC、NKG2A-PE、NKG2C-PE、NKGD2-PE、DNAM-1-PE、CD25-PE、CD69-PE。 前方/側方散乱設定に続いて、NK 細胞は 2 つの細胞サブセット、すなわち CD3- および CD56dim CD16+ 細胞 (CD56dim NK 細胞、主要なサブセット、約 90%)、および CD3- および CD56bright CD16-/low 細胞 ( CD56bright NK 細胞、マイナーサブセット、約 10%)。 他のマーカーの発現は、ゲートされた細胞の両方のサブセットで評価されます。

単球表現型解析の ex vivo FACS 評価では、FACS チューブあたり 2.5x105 の新鮮な全 PBMC を、次のような mAb で 4°C で 30 分間染色します: CD45-APC、CD14-FITC および CD16-V450、PE-CD209 PE-CD80。 前方/側方散乱設定に続いて、単球は 3 つのサブセット、すなわち CD14+ および CD16- 細胞 (メインサブセット、約 90%)、CD14+ CD16+ (マイナーサブセット、約 10%)、および CD14-/低 CD16+ として識別されます。 (他のマイナーなサブセット)。

また、前述のように、CD3-PerCP、CD4-APC、CD8-V450、および制御性 T (Treg ) 細胞、CD3-PerCP、CD4-APC、CD25-PE など。

PBMC は、LPS (TLR4 によって認識される)、ポリ (I:C) (TLR3 によって認識される)、ポリ (I:C) プラス IL-2 プラスなど、さまざまな種類の刺激で 4 時間インビトロで刺激されます。 IL-12、ホルボール ミリステート アセテート (PMA) とモネンシンおよびブレフェルジンの存在下でのイオノマイシン。 この手順により、以前に説明したように (REFF)、FACS 細胞内アッセイを使用して、NK 細胞および単球からの特定のサイトカイン/ケモカイン産生を研究できます。 NK細胞については、IFN-α-PE、TNF-PE、CCL2-PE、CXCL10-PE、CD107a-PE（脱顆粒マーカー）を測定します。 単球については、以下を調査します: IL-6-PE、TNFa-PE、IL-12-PE、CXCL10-PE (M1 型炎症誘発性マーカー) および TGFb-PE、IL-10-PE、CCL18-PE (M2 PBMCs の量が十分である場合はいつでも、NK 細胞および単球に関する他の機能的 in vitro テストが設定されます。 特に、ＰＢＭＣは、フロー細胞蛍光アッセイ（ＲＥＦＦ）を使用して表面ＣＤ１０７ａ－ＰＥを評価する赤血球Ｋ５６２細胞株に対する４時間のＮＫ細胞脱顆粒／細胞毒性機能について研究される。

PBMCの量が十分である場合はいつでも、単球は抗CD14マイクロビーズと磁気セパレーター、NK細胞とRosetteSepキットを使用して精製され、>90%の精製細胞集団が得られます。

精製された単球と精製された NK は、10%FBS を含む RPMI 1640 培地を使用して分離または一緒に培養し、M-CSF と IL-2 をそれぞれ追加し、異なる刺激 (上記参照) で刺激し、細胞内サイトカインをチェックすることができます。 /対象のケモカイン (上記参照)。 同時に、in vitro インキュベーション培養の最後に上清 (ならし培地、CM) を回収し、ELISA (IL-1b、IL-6、TNFa、IFNa、IL-10、IL- 12、CXCL10)。

単球の 4-5 日間の in vitro 培養は、表面 M1 マーカー (TNF、CXCL10) または M2 マーカーを研究するマクロファージ分極を調査するために、LPS と IFNg (M1 刺激) または (IL-4) (M2 刺激) で 24 時間さらに刺激されます。 （IL-10、CCL18）Covid-19患者のさまざまなグループにおけるマクロファージ分極の有病率を確認します。

疫学的分析は、ワクチン接種歴と入院後に毎日収集されるデータの両方を統合して実行されます。 ATS Insubria アーカイブは、不足しているデータを提供します。

免疫学的プロファイルを考慮して、Covid-19の患者は定期検査と次の検査を受けます。

  • リンパ球免疫表現型検査;
  • C3 および C4 補体画分活性の測定;
  • 免疫グロブリン (IgG、IgM、IgA、IgE) 血清レベル;
  • 血清タンパク質電気泳動;
  • アンギオテンシン変換酵素 (ACE) 血清レベル;
  • CMV（シトメガロウイルス）血清検査;
  • IL-6血清レベル。

研究の種類

研究の種類

臨床研究の性質について説明します。研究の種類には、介入研究 (臨床試験とも呼ばれます)、観察研究 (患者登録を含む)、および拡張アクセスが含まれます。
観察的

入学 (予想される)

入学

臨床試験の参加者数。 「予想される」登録は、研究者が研究に必要とする参加者の目標数です。
150

連絡先と場所

このセクションには、調査を実施する担当者の連絡先の詳細と、この調査が実施されている場所に関する情報が記載されています。

研究連絡先

研究連絡先

臨床試験の登録に関する質問に回答できる担当者の名前と連絡先情報。研究が実施されている各場所には、これらの質問により適切に回答できる特定の連絡先がある場合もあります。

研究連絡先のバックアップ

研究場所

  • イタリア
      • Varese、イタリア、21100
        • 募集
        • ATS Insubria
        • コンタクト：
        • 主任研究者：
          • Giuseppe Ietto, MD
        • 主任研究者：
          • Lorenzo Mortara, Professor
        • 副調査官：
          • Domenico Iovino, MD
        • 副調査官：
          • Daniela Dalla Gasperina, Professor
        • 主任研究者：
          • Giulio Carcano, Professor
        • 副調査官：
          • Andreina Baj, MD
        • 副調査官：
          • Walter Ageno, Professor
        • 副調査官：
          • Francesco Acquati, Professor
        • 副調査官：
          • Angelo Genoni, Dr
        • 副調査官：
          • Denisa Baci, PhD
        • 副調査官：
          • Matteo Gallazzi, PhD
        • 副調査官：
          • Annarosaria De Vito, PhD
        • 副調査官：
          • Elisa Monti, MD
        • 副調査官：
          • Andrea Vigezzi, MD
        • 副調査官：
          • Caterina Franchi, MD
        • 副調査官：
          • Valentina Iori, MD
        • 副調査官：
          • Federica Masci, MD

参加基準

研究者は、適格基準と呼ばれる特定の説明に適合する人を探します。これらの基準のいくつかの例は、人の一般的な健康状態または以前の治療です。

適格基準

適格基準

臨床研究への参加を希望する人々が満たさなければならない重要な要件、または彼らが持つべき特徴。適格基準は、包含基準 (人が研究に参加するために必要な基準) と除外基準 (人が研究に参加するのを妨げる基準) の両方で構成されます。適格基準のタイプには、研究が健康なボランティアを受け入れるかどうか、年齢または年齢グループの要件があるかどうか、または性別によって制限されるかどうかが含まれます。

就学可能な年齢

18年歳以上 (大人、高齢者)

健康ボランティアの受け入れ

いいえ

受講資格のある性別

全て

サンプリング方法

非確率サンプル

調査対象母集団

SARS-CoV-2 陽性の患者

説明

包含基準:

  • 年齢: 18歳以上
  • SARS-CoV-2 感染の記録

除外基準:

  • 同意書への署名の拒否 (インフォームド コンセント);
  • 契約書に署名できない;
  • HIV、HCV、HBV（HBs抗原陽性）感染症。

研究計画

このセクションでは、研究がどのように設計され、研究が何を測定しているかなど、研究計画の詳細を提供します。

研究はどのように設計されていますか？

デザインの詳細

  • 観測モデル：ケースのみ
  • 時間の展望：見込みのある

コホートと介入

グループ/コホート

グループ/コホート

生物医学的または健康上の結果について評価される観察研究の参加者のグループまたはサブグループ。
介入・治療

介入・治療

臨床研究の焦点となるプロセスまたはアクション。介入には、医薬品、医療機器、処置、ワクチン、および治験中またはすでに利用可能なその他の製品が含まれます。介入には、教育や食事や運動の変更などの非侵襲的アプローチも含まれます。
SARS-CoV-2の検査で陽性
SARS-CoV-2 陽性と診断された患者は、ヴァレーゼにある「Ospedale Di Circolo - ASST Settelaghi」教育病院の E.R. で募集されます。
診断テスト：SARS-CoV-2陽性患者における免疫介在メカニズムの研究
単球およびNK細胞の表現型および機能解析

この研究は何を測定していますか？

主要な結果の測定

主要な結果の測定

臨床研究のプロトコルにおいて、介入/治療の効果を評価するために最も重要な、計画された結果の尺度。ほとんどの臨床研究には 1 つの主要な結果の測定値がありますが、複数の測定値を持つものもあります。
結果測定
メジャーの説明
時間枠
免疫細胞の活動
時間枠：6ヶ月
科学者の仮説は、SARS-CoV-2 に重症感染した患者の単球、NK、CD4 および CD8 T 細胞が機能障害を示すというものです。炎症性サイトカイン、浮腫、肺線維症。
6ヶ月

二次結果の測定

二次結果の測定

臨床研究のプロトコルにおいて、介入の効果を評価するための主要な結果測定ほど重要ではないが、依然として重要な計画された結果測定。ほとんどの臨床研究には、複数の副次的アウトカム指標があります。
結果測定
メジャーの説明
時間枠
保護因子と新しい治療戦略
時間枠：6ヶ月
二次的な目的は、臨床データとワクチン接種歴を実験室の免疫パターンと関連付けて、Covid 19 の防御因子を特定し、新しい治療戦略への道を開くことです。
6ヶ月

協力者と研究者

ここでは、この調査に関係する人々や組織を見つけることができます。

スポンサー

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研究を開始し、研究に対する権限と管理権を持つ組織または個人。
Università degli Studi dell'Insubria

捜査官

捜査官

臨床研究に携わる研究者。関連用語には、施設主任研究者、施設副調査官、研究委員長、研究責任者、および研究主任研究者が含まれます。
  • スタディチェア：Giulio Carcano, Professor、Università degli Studi dell'Insubria
  • 主任研究者：Giuseppe Ietto, M.D.、Università degli Studi dell'Insubria
  • 主任研究者：Lorenzo Mortara, Professor、Università degli Studi dell'Insubria

出版物と役立つリンク

研究に関する情報を入力する責任者は、自発的にこれらの出版物を提供します。これらは、研究に関連するあらゆるものに関するものである可能性があります。

一般刊行物

研究記録日

これらの日付は、ClinicalTrials.gov への研究記録と要約結果の提出の進捗状況を追跡します。研究記録と報告された結果は、国立医学図書館 (NLM) によって審査され、公開 Web サイトに掲載される前に、特定の品質管理基準を満たしていることが確認されます。

主要日程の研究

研究開始 (実際)

研究開始

最初の参加者が臨床試験に登録された実際の日付。 「予想される」研究開始日は、研究者が研究開始日になると考える日付です。
2020年4月27日

一次修了 (予想される)

一次修了

臨床研究の最後の参加者が検査された、または主要な結果測定のための最終データを収集するための介入を受けた日付。治験がプロトコルに従って終了したか終了したかは、この日付には影響しません。完了日が異なる複数の主要評価項目を含む臨床研究の場合、この用語は、すべての主要評価項目のデータ収集が完了した日付を指します。 「予想される」一次完了日は、研究者がその研究の一次完了日になると考える日付です。
2020年6月30日

研究の完了 (予想される)

研究の完了

臨床研究の最後の参加者が検査された、または介入/治療を受けて、主要な結果の尺度、副次的な結果の尺度、および有害事象の最終データを収集した日付 (つまり、最後の参加者の最後の訪問)。 「予想される」研究完了日は、研究者が研究完了日になると考える日付です。
2020年10月31日

試験登録日

最初に提出

最初に提出

治験依頼者または治験責任医師が初めて治験記録を ClinicalTrials.gov に提出した日付。通常、最初の提出日と ClinicalTrials.gov での記録の利用可能日 (最初の投稿日) の間には数日の遅延があります。
2020年5月3日

QC基準を満たした最初の提出物

QC基準を満たした最初の提出物

研究スポンサーまたは治験責任医師が、国立医学図書館 (NLM) の品質管理 (QC) 審査基準と一致する研究記録を最初に提出した日付。治験依頼者または研究者は、NLM の QC 審査基準が満たされるまでに、研究記録を 1 回または複数回修正して提出する必要がある場合があります。研究記録がNLM QC審査基準と一致していることを確認するのは、治験依頼者または治験責任医師の責任です。
2020年5月3日

最初の投稿 (実際)

最初の投稿

国立医学図書館 (NLM) の品質管理 (QC) レビューが終了した後、ClinicalTrials.gov で研究記録が最初に利用可能になった日付。通常、治験依頼者または治験責任医師が治験記録を提出した日と最初に投稿された日との間には数日の遅延があります。
2020年5月5日

学習記録の更新

投稿された最後の更新 (実際)

投稿された最後の更新

ClinicalTrials.gov で、研究記録が変更された最新の日付。研究のスポンサーまたは治験責任医師によって変更が ClinicalTrials.gov に提出されたとき (最終更新が提出された日) と最終更新が投稿された日との間に遅延が生じる場合があります。
2020年5月5日

QC基準を満たした最後の更新が送信されました

QC基準を満たした最後の更新が送信されました

治験依頼者または治験責任医師が、国立医学図書館（NLM）の品質管理（QC）審査基準と一致する治験記録の変更を提出した最新の日付。研究記録がNLM QC審査基準と一致していることを確認するのは、治験依頼者または治験責任医師の責任です。
2020年5月3日

最終確認日

最終確認日

治験依頼者または治験責任医師が、ClinicalTrials.gov で臨床治験に関する情報が正確かつ最新であることを確認した最新の日付。募集ステータスが募集中の研究の場合。まだ募集していません。過去 2 年以内に募集が確認されていない場合、研究の募集状況は不明として表示されます。
2020年5月1日

詳しくは

本研究に関する用語

追加の関連 MeSH 用語

その他の研究ID番号

その他の研究ID番号

NCT 番号以外の識別子または ID 番号で、治験依頼者、資金提供者、その他によって臨床治験に割り当てられたもの。これらの番号には、他の治験登録機関や国立衛生研究所の助成金番号からの一意の識別子が含まれる場合があります。
  • 67/2020

個々の参加者データ (IPD) の計画

個々の参加者データ (IPD) を共有する予定はありますか?

未定

医薬品およびデバイス情報、研究文書

米国FDA規制医薬品の研究

いいえ

米国FDA規制機器製品の研究

いいえ

この情報は、Web サイト clinicaltrials.gov から変更なしで直接取得したものです。研究の詳細を変更、削除、または更新するリクエストがある場合は、register@clinicaltrials.gov。 までご連絡ください。 clinicaltrials.gov に変更が加えられるとすぐに、ウェブサイトでも自動的に更新されます。

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