Covid-19患者における単球とNK細胞の活性
SARS-CoV-2陽性患者における免疫介在メカニズムの研究：Covid 19の影響を受けた被験者の血液中の単球およびNK細胞の表現型および機能分析
SARS-CoV-2 はベータコロナウイルス科に属し、その感染経路と症状はすべての市中感染型コロナウイルスと同じです。 新型コロナウイルスの主な違いは、致死率が約 3% と高いことです。
死亡率は 50 歳以上の患者でのみ 1% を超えていますが、40 歳までは 0.4% 未満です。 現在までに、10 歳未満の子供の死亡は報告されていません。 死亡率は、女性よりも男性の方がほぼ 2 倍です。 感染患者の年齢による死亡率のこの分布は、高齢に加えて他の併存疾患に部分的にのみ起因する可能性があります。 実際、既往症のない患者の致死率は 0.9% です。
小児および一般的に 40 歳未満の患者の重症化率がほぼゼロであることは、まったく説明のつかないことです。 幼児、子供、若者が感染する可能性がありますが、感染は急速に自然治癒するか、無症状です。 高齢の患者は、免疫応答が遅れて起こるため、重度の肺損傷を起こします。
これらの現象の考えられる説明は、ウイルス自体の新規性とは無関係に、若年層の SARS-CoV-2 への迅速な対応を保証するものである可能性があります。
若い人たちは、以前の接触なしにウイルスの抗原にすでに感作されているようです.
この免疫は実際には特異的ではありませんが、ウイルスの多くの抗原に対して「部分的に特異的」ですが、生物の感染を制限することができます. 何かが免疫系を刺激し、ますます多くの抗原に対して免疫を分散させました。 子供は、地域社会を循環するすべてのウイルスに最もさらされている年齢層です。
この免疫は永続的ではなく、徐々に消えていきます。 ゆっくりと減少するため、仮想的な刺激が発生する2歳から50歳まで保護します。
健康な人が受ける唯一の外的刺激はワクチンです。 すべての予防接種、特に破傷風、ジフテリア トキソイド、および百日咳などの不活化細菌は、免疫システムを刺激する可能性があります。 それらは特定の免疫を発達させますが、コロナウイルスや他のコミュニティを循環するウイルスのように、通過中の抗原に対する発芽免疫も生成します.
開発された免疫は、自然消滅するまで何年にもわたって複数のウイルス感染に対してある程度の保護を提供します.
50 年を過ぎると、その免疫は回復と再活性化が遅くなります。 さらに、免疫系が阻害されている移植レシピエントと HIV 感染患者は、予想外に、SARS-CoV-2 感染の最悪の合併症に苦しむようには見えません。 免疫系の不均衡は、ウイルスへの反応中に極めて重要な役割を果たし、過度の炎症の破壊的な結果を制限する可能性があります.
プロトコルが基づいている医学的仮説によると、若い人々は、エピジェネティックな再プログラミングを通じて誘導される自然免疫細胞の機能的適応、特に「バイスタンダー」によって引き起こされるコミュニティウイルスに対する既存の「部分的に特異的な」免疫から恩恵を受ける可能性があります。事前の予防接種の効果」。 この研究では、重症度の異なるSARS-CoV-2に感染した患者の間に存在する主な違いを探ります。 私たちは、それぞれが特定の免疫学的パターンを持つさまざまな患者集団を認識すると想定しています。 それは、サイトカイン、可溶性因子の血清レベル、および自然コンパートメントと後天コンパートメントの両方の免疫細胞活性の点で異なる可能性があります。 Covid-19の病因におけるこれらの免疫学的現象の役割の証拠は、治療的免疫調節治療の実施の基礎です. さらに、免疫学的リスクプロファイルの定義により、確立された治療法を各種類の患者に合わせて調整することができます。
調査の概要
状態
詳細な説明
プロトコルが基づいている医学的仮説によると、若い人々は、エピジェネティックな再プログラミングを通じて誘導される自然免疫細胞の機能的適応、特に「バイスタンダー」によって引き起こされるコミュニティウイルスに対する既存の「部分的に特異的な」免疫から恩恵を受ける可能性があります。事前の予防接種の効果」。 この研究では、重症度の異なるSARS-CoV-2に感染した患者の間に存在する主な違いを探ります。 私たちは、それぞれが特定の免疫学的パターンを持つさまざまな患者集団を認識すると想定しています。 それは、サイトカイン、可溶性因子の血清レベル、および自然コンパートメントと後天コンパートメントの両方の免疫細胞活性の点で異なる可能性があります。
データは 3 つのアプローチを使用して収集されます。
- 自然免疫応答を研究し、遺伝子プロファイルを特定するための、患者群の実験的分析。
- 患者のワクチン接種歴を特定するための疫学的分析。
- 免疫学的プロファイルを検出するための臨床分析;
特定の分析のために、自然免疫応答を研究し、遺伝的プロファイルを特定するために、科学者は末梢血から、両方のグループのNK細胞、単球、CD4およびCD8 T細胞を分析します：健康な患者（SARS-CoVの検査で陰性） -2) およびサブグループの病気の患者 (AS 19、PAU19、POL19、ARD19)。
患者のさまざまなグループから、血液サンプル (10 ～ 15 mL) を EDTA チューブに採取し、360 g で 10 分間遠心分離して血漿を取得し、その後の対象のサイトカインおよびケモカインの分析のために -80 °C で保存します。登録終了時のELISA（IL-1b、IL-6、TNF、IFN-α、IL-10、IL-12、CCL2およびCXCL10）による。
細胞ペレットをＰＢＳで元の容量に戻し、１：１（ｖ／ｖ）に希釈し、次いでＦｉｃｏｌｌ Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７を用いて５００ｇで３０分間密度勾配層別化する。 ホワイト リングに由来する末梢血単核細胞 (PBMC) が収集され、PBS で 2 回洗浄され、フローサイトメーター アッセイ (REFF) を使用した後続の実験に使用されます。 PBMC を使用した in vitro 培養は、ex vivo で 1 日から数日まで変化し、細胞は 10% ウシ胎児血清 (FBS)、2 mM l-グルタミン、100 U/mL ペニシリンを添加した RPMI 1640 培地で維持されます。および 100 μg/mL ストレプトマイシン (P/S)、37°C、5% CO2。
ex vivo 蛍光活性化セルソーター (FACS) 表現型分析を行うには、FACS チューブあたり 2.5x105 の新鮮な全 PBMC を、次のようなモノクローナル抗体 (mAb) で 4°C で 30 分間染色します: CD3-PerCP、CD56-APC 、CD16-FITC、NKG2A-PE、NKG2C-PE、NKGD2-PE、DNAM-1-PE、CD25-PE、CD69-PE。 前方/側方散乱設定に続いて、NK 細胞は 2 つの細胞サブセット、すなわち CD3- および CD56dim CD16+ 細胞 (CD56dim NK 細胞、主要なサブセット、約 90%)、および CD3- および CD56bright CD16-/low 細胞 ( CD56bright NK 細胞、マイナーサブセット、約 10%)。 他のマーカーの発現は、ゲートされた細胞の両方のサブセットで評価されます。
単球表現型解析の ex vivo FACS 評価では、FACS チューブあたり 2.5x105 の新鮮な全 PBMC を、次のような mAb で 4°C で 30 分間染色します: CD45-APC、CD14-FITC および CD16-V450、PE-CD209 PE-CD80。 前方/側方散乱設定に続いて、単球は 3 つのサブセット、すなわち CD14+ および CD16- 細胞 (メインサブセット、約 90%)、CD14+ CD16+ (マイナーサブセット、約 10%)、および CD14-/低 CD16+ として識別されます。 (他のマイナーなサブセット)。
また、前述のように、CD3-PerCP、CD4-APC、CD8-V450、および制御性 T (Treg ) 細胞、CD3-PerCP、CD4-APC、CD25-PE など。
PBMC は、LPS (TLR4 によって認識される)、ポリ (I:C) (TLR3 によって認識される)、ポリ (I:C) プラス IL-2 プラスなど、さまざまな種類の刺激で 4 時間インビトロで刺激されます。 IL-12、ホルボール ミリステート アセテート (PMA) とモネンシンおよびブレフェルジンの存在下でのイオノマイシン。 この手順により、以前に説明したように (REFF)、FACS 細胞内アッセイを使用して、NK 細胞および単球からの特定のサイトカイン/ケモカイン産生を研究できます。 NK細胞については、IFN-α-PE、TNF-PE、CCL2-PE、CXCL10-PE、CD107a-PE（脱顆粒マーカー）を測定します。 単球については、以下を調査します: IL-6-PE、TNFa-PE、IL-12-PE、CXCL10-PE (M1 型炎症誘発性マーカー) および TGFb-PE、IL-10-PE、CCL18-PE (M2 PBMCs の量が十分である場合はいつでも、NK 細胞および単球に関する他の機能的 in vitro テストが設定されます。 特に、ＰＢＭＣは、フロー細胞蛍光アッセイ（ＲＥＦＦ）を使用して表面ＣＤ１０７ａ－ＰＥを評価する赤血球Ｋ５６２細胞株に対する４時間のＮＫ細胞脱顆粒／細胞毒性機能について研究される。
PBMCの量が十分である場合はいつでも、単球は抗CD14マイクロビーズと磁気セパレーター、NK細胞とRosetteSepキットを使用して精製され、>90%の精製細胞集団が得られます。
精製された単球と精製された NK は、10%FBS を含む RPMI 1640 培地を使用して分離または一緒に培養し、M-CSF と IL-2 をそれぞれ追加し、異なる刺激 (上記参照) で刺激し、細胞内サイトカインをチェックすることができます。 /対象のケモカイン (上記参照)。 同時に、in vitro インキュベーション培養の最後に上清 (ならし培地、CM) を回収し、ELISA (IL-1b、IL-6、TNFa、IFNa、IL-10、IL- 12、CXCL10)。
単球の 4-5 日間の in vitro 培養は、表面 M1 マーカー (TNF、CXCL10) または M2 マーカーを研究するマクロファージ分極を調査するために、LPS と IFNg (M1 刺激) または (IL-4) (M2 刺激) で 24 時間さらに刺激されます。 （IL-10、CCL18）Covid-19患者のさまざまなグループにおけるマクロファージ分極の有病率を確認します。
疫学的分析は、ワクチン接種歴と入院後に毎日収集されるデータの両方を統合して実行されます。 ATS Insubria アーカイブは、不足しているデータを提供します。
免疫学的プロファイルを考慮して、Covid-19の患者は定期検査と次の検査を受けます。
- リンパ球免疫表現型検査;
- C3 および C4 補体画分活性の測定;
- 免疫グロブリン (IgG、IgM、IgA、IgE) 血清レベル;
- 血清タンパク質電気泳動;
- アンギオテンシン変換酵素 (ACE) 血清レベル;
- CMV（シトメガロウイルス）血清検査;
- IL-6血清レベル。
研究の種類
入学 (予想される)
連絡先と場所
研究場所
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Varese、イタリア、21100
- 募集
- ATS Insubria
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コンタクト：
- Giuseppe Ietto, M.D.
- 電話番号：+393398758024
- メール：giuseppe.ietto@gmail.com
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主任研究者：
- Giuseppe Ietto, MD
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主任研究者：
- Lorenzo Mortara, Professor
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副調査官：
- Domenico Iovino, MD
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副調査官：
- Daniela Dalla Gasperina, Professor
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主任研究者：
- Giulio Carcano, Professor
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副調査官：
- Andreina Baj, MD
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副調査官：
- Walter Ageno, Professor
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副調査官：
- Francesco Acquati, Professor
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副調査官：
- Angelo Genoni, Dr
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副調査官：
- Denisa Baci, PhD
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副調査官：
- Matteo Gallazzi, PhD
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副調査官：
- Annarosaria De Vito, PhD
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副調査官：
- Elisa Monti, MD
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副調査官：
- Andrea Vigezzi, MD
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副調査官：
- Caterina Franchi, MD
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副調査官：
- Valentina Iori, MD
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副調査官：
- Federica Masci, MD
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参加基準
適格基準
就学可能な年齢
健康ボランティアの受け入れ
受講資格のある性別
サンプリング方法
調査対象母集団
説明
包含基準:
- 年齢: 18歳以上
- SARS-CoV-2 感染の記録
除外基準:
- 同意書への署名の拒否 (インフォームド コンセント);
- 契約書に署名できない;
- HIV、HCV、HBV（HBs抗原陽性）感染症。
研究計画
研究はどのように設計されていますか？
デザインの詳細
- 観測モデル：ケースのみ
- 時間の展望：見込みのある
コホートと介入
グループ/コホート |
介入・治療 |
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SARS-CoV-2の検査で陽性
SARS-CoV-2 陽性と診断された患者は、ヴァレーゼにある「Ospedale Di Circolo - ASST Settelaghi」教育病院の E.R. で募集されます。
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単球およびNK細胞の表現型および機能解析
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この研究は何を測定していますか？
主要な結果の測定
結果測定 |
メジャーの説明 |
時間枠 |
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免疫細胞の活動
時間枠：6ヶ月
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科学者の仮説は、SARS-CoV-2 に重症感染した患者の単球、NK、CD4 および CD8 T 細胞が機能障害を示すというものです。炎症性サイトカイン、浮腫、肺線維症。
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6ヶ月
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二次結果の測定
結果測定 |
メジャーの説明 |
時間枠 |
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保護因子と新しい治療戦略
時間枠：6ヶ月
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二次的な目的は、臨床データとワクチン接種歴を実験室の免疫パターンと関連付けて、Covid 19 の防御因子を特定し、新しい治療戦略への道を開くことです。
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6ヶ月
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協力者と研究者
捜査官
- スタディチェア：Giulio Carcano, Professor、Università degli Studi dell'Insubria
- 主任研究者：Giuseppe Ietto, M.D.、Università degli Studi dell'Insubria
- 主任研究者：Lorenzo Mortara, Professor、Università degli Studi dell'Insubria
出版物と役立つリンク
一般刊行物
- Netea MG, Dominguez-Andres J, Barreiro LB, Chavakis T, Divangahi M, Fuchs E, Joosten LAB, van der Meer JWM, Mhlanga MM, Mulder WJM, Riksen NP, Schlitzer A, Schultze JL, Stabell Benn C, Sun JC, Xavier RJ, Latz E. Defining trained immunity and its role in health and disease. Nat Rev Immunol. 2020 Jun;20(6):375-388. doi: 10.1038/s41577-020-0285-6. Epub 2020 Mar 4.
- Benn CS, Netea MG, Selin LK, Aaby P. A small jab - a big effect: nonspecific immunomodulation by vaccines. Trends Immunol. 2013 Sep;34(9):431-9. doi: 10.1016/j.it.2013.04.004. Epub 2013 May 14.
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- Murray PJ, Allen JE, Biswas SK, Fisher EA, Gilroy DW, Goerdt S, Gordon S, Hamilton JA, Ivashkiv LB, Lawrence T, Locati M, Mantovani A, Martinez FO, Mege JL, Mosser DM, Natoli G, Saeij JP, Schultze JL, Shirey KA, Sica A, Suttles J, Udalova I, van Ginderachter JA, Vogel SN, Wynn TA. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 2014 Jul 17;41(1):14-20. doi: 10.1016/j.immuni.2014.06.008.
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- Morandi F, Horenstein AL, Chillemi A, Quarona V, Chiesa S, Imperatori A, Zanellato S, Mortara L, Gattorno M, Pistoia V, Malavasi F. CD56brightCD16- NK Cells Produce Adenosine through a CD38-Mediated Pathway and Act as Regulatory Cells Inhibiting Autologous CD4+ T Cell Proliferation. J Immunol. 2015 Aug 1;195(3):965-72. doi: 10.4049/jimmunol.1500591. Epub 2015 Jun 19.
- Ietto G, Mortara L, Dalla Gasperina D, Iovino D, Azzi L, Baj A, Ageno W, Genoni AP, Acquati F, Gallazzi M, Spina G, Coco G, Pierin F, Noonan D, Vigezzi A, Monti E, Iori V, Masci F, Franchi C, Di Saverio S, Carcano G. Immune-Mediated Mechanisms in Patients Testing Positive for SARS-CoV-2: Protocol for a Multianalysis Study. JMIR Res Protoc. 2022 Jan 25;11(1):e29892. doi: 10.2196/29892.
研究記録日
主要日程の研究
研究開始 (実際)
一次修了 (予想される)
研究の完了 (予想される)
試験登録日
最初に提出
QC基準を満たした最初の提出物
最初の投稿 (実際)
学習記録の更新
投稿された最後の更新 (実際)
QC基準を満たした最後の更新が送信されました
最終確認日
詳しくは
本研究に関する用語
追加の関連 MeSH 用語
その他の研究ID番号
- 67/2020
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医薬品およびデバイス情報、研究文書
米国FDA規制医薬品の研究
米国FDA規制機器製品の研究
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