慢性C型肝炎ウイルス感染患者におけるインターフェロンおよびリバビリン治療の薬理ゲノミクス

背景と研究計画:

慢性 HCV 感染症は、多くの場合、長年にわたって進行性の経過をたどり、最終的には肝硬変を引き起こし、肝移植や肝細胞癌が必要になる場合があります。 慢性 C 型肝炎感染症患者の治療決定は、病気の自然経過と病期、治療に関連する有効性と副作用などのいくつかの要因に基づいて行われます。 原則として、治療が考慮される患者は、慢性感染の組織学的およびウイルス学的証拠（すなわち、血清中で検出可能な HCV RNA）および血清 ALT の上昇が必要です（1）。 インターフェロンとリバビリンの併用治療は、現在、慢性 HCV 感染症に対して利用可能な最良の治療法です。 しかし、治療に対する反応は最適とは言えず、いくつかの副作用があります。

インターフェロンとリバビリンによる患者の治療中に見られる副作用には、主にインターフェロンによるインフルエンザ様の症状、血球減少症、リバビリンによって引き起こされる溶血などがあります。 インターフェロンによる精神変化は最大 50% で発生し、治療を必要とする甲状腺異常はインターフェロンで治療された約 1 ～ 5% で発生します。 自己免疫疾患や網膜出血も報告されています。 さらに、治療には貧血が伴う可能性があるため、併用療法は腎機能障害、心疾患、溶血性貧血のある患者において重大なリスクを伴います。 うつ病や自殺願望のある患者も除外されるべきです(2)。

この時点まで、HCV を使用した DNA マイクロアレイ研究はほとんど行われていません。 しかし、これまでに行われた研究は興味深いものであり、将来性を示しています。 B型肝炎（HBV）とC型肝炎を比較した研究では、HBV感染では主に炎症に関与する遺伝子が発現していることが判明しました。 対照的に、HCV 感染では抗炎症遺伝子が発現することが判明しました (3)。 別の研究では、HCV 関連肝硬変は、炎症促進性、線維化促進性、およびアポトーシス促進性の遺伝子発現プロファイルによって特徴付けられることが示されています (4)。

持続感染、一過性ウイルス除去、または持続的除去を発症する急性感染チンパンジーの肝生検の遺伝子発現分析により、HCV 感染の進行が検査されています。 一時的および持続的なウイルスクリアランスは、IFN-ガンマ誘導遺伝子、および抗原のプロセシングと提示、および適応免疫応答に関与する他の遺伝子の誘導と独特に関連していました。 この研究により、感染の確立、広がり、制御を反映するゲノム全体の転写変化が明らかになり、HCV 感染の除去に関連する潜在的にユニークな抗ウイルスプログラムが明らかになりました (5)。

ヒト細胞株 Huh7 での in vitro 研究では、細胞をインターフェロンに曝露すると、対照クローンでは 50 遺伝子が少なくとも 2 倍上方制御されたのに対し、Huh7 発現クローンでは 50 遺伝子のうち 9 遺伝子の誘導が大幅に減少したことが示されました。 NS5A。 インターフェロンアルファ活性は、HCV タンパク質 NS5A によって阻害されることがわかっています。 インターフェロン応答に対する NS5A の最も強い効果は、発現が低下した OAS-p69 遺伝子で観察されました。 さらに、NS5A を発現する Huh7 細胞は、炎症誘発性サイトカインであるインターロイキン 8 の上方制御を示しました。 結果として、この研究は NS5A 媒介インターフェロン耐性のメカニズムを仮定しました (6)。

最近の研究では、インターフェロンアルファで治療されたC型肝炎患者の末梢血単核細胞のマイクロアレイ遺伝子プロファイリングが行われました。 抗原のプロセシングと提示、T細胞の活性化、リンパ球輸送、エフェクター機能に関与する遺伝子を含む、免疫細胞の機能に直接関連する88個の遺伝子が上方制御されており、インターフェロンαが免疫のさまざまな側面に関与する複数の遺伝子を上方制御していることが示唆されています。 C 型肝炎ウイルスに対する免疫を強化する反応 (7)。

現在、HCV の治療には未だにかなりの無反応率があり、副作用が伴うため、多くの人が治療を受けることが制限されています。 すでに、DNAマイクロアレイによる分子プロファイリングにより、HCV関連肝炎の発症に関与する可能性のある潜在的な遺伝子標的、さらに重要なことに、インターフェロン治療に応答して役割を果たす可能性のある標的が同定されている。 ここで提案された研究は、この一連の知識に基づいて構築され、HCV の治療法の改善につながる可能性があることを望んでいます。

方法/実験計画:

アルフレッド病院倫理委員会からの承認が得られ、被験者はアルフレッド病院の肝炎クリニックを通じて募集されます。 研究の目的は口頭および平易な英語の声明によって説明された後、研究に対するインフォームドコンセントが得られます。 インフォームドコンセントには肝生検に対する同意も含まれます。 最初に、パイロット研究が実施され、研究の実験部門と対照部門の両方に 1 人の被験者のみが採用されます。 このパイロット研究の結果が分析されると、研究はさらに多くの人々を対象に拡大される予定です。

肝生検は以下のグループに対して実施されます。

1. 標準またはペグ化インターフェロンとリバビリンによる治療の開始前および終了時のHCV陽性患者。 このグループは、治療に対する反応者と非反応者にさらに分類されます。 このグループでは、治療開始前に超音波ガイド下での肝肝生検がすでに定期的に行われています。 この研究の目的では、併用療法に対する非反応者は、治療終了時に HCV-RNA 陽性のままである個人です。
2. 対照集団は、肝臓に関与しない疾患のために開腹術を受けた患者で構成されます。 これらの生検は手術時に採取されます。

オリゴ dT クロマトグラフィーによってメッセンジャー RNA (mRNA) を単離するのに十分な肝臓組織 (約 1 ～ 2 mg) が得られます。 mRNA が単離されると、相補的 DNA (cDNA) に逆転写されます。 次に、この cDNA は蛍光レポーター分子で標識されます。 標識された肝臓 cDNA と DNA マイクロアレイのハイブリダイゼーションが起こります。 マイクロアレイは市販されており、ヒトcDNAから構成されることが想定されている。 マイクロアレイ上には、異なる蛍光マーカーで標識された肝臓 cDNA の 2 つのロット（つまり、 赤と緑）は、干渉することなく同時にアレイにハイブリダイズできます。 次に、次のハイブリダイゼーションが設定されます。

レポーター分子 1: HCV +ve グループ。 cDNA レポーター分子 2: HCV -ve グループ。 cDNA

ハイブリダイゼーション 1 レスポンダーから Rx。 Rx コントロール前 cDNA

Rx へのハイブリダイゼーション 2 レスポンダー。 Rx コントロール cDNA 後

ハイブリダイゼーション 3 Rx に応答しません。 Rx コントロール前 cDNA

ハイブリダイゼーション 4 Rx に応答しません。 Rx コントロール cDNA 後

Rx = 治療。

次に、ハイブリダイズされたアレイがスキャンされ、結果の解釈を支援するために市販のソフトウェア パッケージが使用されます (8)。 特に関心のある遺伝子または遺伝子グループには以下が含まれます。

1. 炎症反応促進遺伝子

   • ガンマ インターフェロン (IFN)、インターロイキン 2 (IL-2)、腫瘍壊死因子ベータ (TNF-β) などの Th-1 サイトカイン。 Th1 サイトカインは、オプソニン化抗体 (IgG1 など) の産生、細胞毒性およびマクロファージ活性化の誘導を促進します。 Th1 応答は、細胞内で複製する病原体に対する防御において顕著です。
   • 腫瘍壊死因子 (TNF) および TNF 受容体ファミリーの分子は、炎症促進性が高く、免疫調節に関与します。
   • インターロイキン-12 (IL-12) は、ウイルスや微生物の感染から宿主を守る重要なサイトカインです。 それは免疫系の先天的および後天的部門を結びつけます。
   • インターロイキン-18 (IL-18) は、化学誘引物質として作用することが示されています。

2. 線維化促進反応に関与する遺伝子。

   • 線維芽細胞の増殖を引き起こすトランスフォーミング成長因子ベータ（TGFベータ）。
   • プロコラーゲンIおよびII。
   • 血小板由来成長因子 (PDGF) および PDGF ベータ受容体の過剰発現は、線維性疾患、癌およびアテローム性動脈硬化症の発症に関連していると考えられています。
   • マトリックスメタロプロテイナーゼは血管新生において極めて重要な役割を果たし、腫瘍形成にも関与します。
   • 線維芽細胞成長因子。
   • 血管内皮増殖因子 (VEGF) は、血管新生特性で知られています。
   • コラーゲンの生成を刺激する結合組織成長因子。

さらに、これまで同定されていなかった発現差のある新規遺伝子が探索され、特徴付けが行われます。

このプロジェクトに関連する参考文献（文献検索より）

1. Chopra, S. 慢性 C 型肝炎感染症の治療: 推奨事項。 出演：アップ・トゥ・デイト、ローズ、BR(エド)、アップ・トゥ・デイト、ウェルズリー。 マサチューセッツ州、2002 年。
2. Bonis、PLA、Chopra、S。C 型肝炎感染症の治療におけるインターフェロン アルファ-2b とリバビリンの併用投与。 出演：アップ・トゥ・デイト、ローズ、BR(エド)、アップ・トゥ・デイト、ウェルズリー。 マサチューセッツ州、2002 年。
3. ホンダ、M、金子、S、川合、H、他 慢性B型肝炎とC型肝炎の間の異なる遺伝子発現。 消化器病学 2001; 120: 955-66。
4. NA シャッケル、PH マクギネス、カリフォルニア州アボット 他 C型肝炎ウイルス関連肝硬変の病態生物学への洞察:肝臓内の差次的遺伝子発現の分析。 Am J Pathol 2002; 160：641-54。
5. Su、AI、Pezacki、JP、Wodicka L、他。 C型肝炎ウイルス感染に対する宿主反応のゲノム解析。 Proc Natl Acad Sci 2002;99:15669-74。
6. ジラール、S、シャルーブ、P、レスキュール、P、他 インターフェロンに対する細胞応答の変化と、C型肝炎ウイルスタンパク質NS5Aによって誘導されるインターロイキン-8の上方制御が、マイクロアレイ解析によって明らかになりました。 ウイルス学 2002; 295：272-83。
7. Ji、X、Cheung、R、Cooper、Sら、慢性C型肝炎に対するインターフェロン治療を開始した患者におけるインターフェロンα調節遺伝子発現、Hepatology 2003;37:610-21。
8. ジェンキンス、RE、ペニントン、SR。タンパク質発現プロファイリング用のアレイ: 二次元ゲル電気泳動に代わる実行可能な代替手段に向けて。 プロテオミクス 2001; 1:12-29。