Farmakogenomikk av interferon- og ribavirinbehandling hos pasienter med kronisk hepatitt C-virusinfeksjon

Bakgrunn og forskningsplan:

Kronisk HCV-infeksjon følger ofte et progressivt forløp over mange år, og kan til slutt resultere i skrumplever og behov for levertransplantasjon eller hepatocellulært karsinom. Beslutningen om å behandle pasienter med kronisk hepatitt C-infeksjon er basert på flere faktorer, inkludert den naturlige historien og sykdomsstadiet og effekten og bivirkningene knyttet til behandlingen. Som en generell regel bør pasienter som vurderes for behandling ha histologiske og virologiske tegn på kronisk infeksjon (dvs. HCV RNA påviselig i serum) og forhøyet serum-ALAT (1). Kombinasjonsbehandling med interferon og ribavirin er i dag den beste tilgjengelige behandlingen for kronisk HCV-infeksjon. Imidlertid er respons på terapi suboptimal og det er flere bivirkninger.

Bivirkninger sett under behandling av pasienter med interferon og ribavirin inkluderer influensalignende symptomer, hovedsakelig på grunn av interferon, cytopenier og hemolyse indusert av ribavirin. Psykiatriske endringer på grunn av interferon forekommer hos opptil 50 %, og skjoldbruskkjertelavvik som krever terapi forekommer hos ca. 1 til 5 % som behandles med interferon. Autoimmun sykdom og netthinneblødninger er også rapportert. I tillegg er kombinasjonsbehandling assosiert med betydelig risiko hos pasienter med nedsatt nyrefunksjon, hjertesykdom og hemolytisk anemi, da behandling kan være assosiert med anemi. Pasienter som er deprimerte eller suicidale bør også ekskluderes (2).

Til dette punktet har lite DNA-mikroarray-arbeid blitt gjort med HCV. Det arbeidet som er gjort er imidlertid interessant og lovende. I studier som sammenlignet hepatitt B (HBV) med hepatitt C, ble HBV-infeksjon funnet å uttrykke gener som hovedsakelig er involvert i betennelse. I motsetning til dette ble det funnet antiinflammatoriske gener ved HCV-infeksjon (3). I en annen studie har HCV-assosiert cirrhose vist seg å være preget av proinflammatoriske, pro-fibrotiske og proapoptotiske genekspresjonsprofiler (4).

Progresjonen av HCV-infeksjon ved genekspresjonsanalyse av leverbiopsier hos akutt infiserte sjimpanser som utvikler vedvarende infeksjon, forbigående viral clearance eller vedvarende clearance har blitt undersøkt. Forbigående og vedvarende viral clearance var unikt assosiert med induksjon av IFN-gamma-induserte gener og andre gener involvert i antigenbehandling og presentasjon og den adaptive immunresponsen. Studien avdekket genomomfattende transkripsjonsendringer som reflekterer etablering, spredning og kontroll av infeksjon, og de avslører potensielt unike antivirale programmer assosiert med eliminering av HCV-infeksjon (5).

In vitro-studier i den humane cellelinjen Huh7 har vist at ved eksponering av cellene for Interferon 50 ble gener oppregulert med minst to ganger i kontrollkloner, mens induksjon av 9 av de 50 genene ble betydelig redusert i de Huh7-kloner som uttrykker NS5A. Interferon-alfa-aktivitet har vist seg å bli hemmet av HCV-proteinet NS5A. Den sterkeste effekten av NS5A på interferonrespons ble observert på OAS-p69-genet med redusert ekspresjon. I tillegg viste Huh7-celler som uttrykker NS5A en oppregulering av interleukin-8, et proinflammatorisk cytokin. Som et resultat postulerte denne studien en mekanisme for NS5A-mediert interferonresistens (6).

I en nylig studie ble det utført mikroarray-genprofilering av mononukleære celler fra perifert blod fra hepatitt C-pasienter behandlet med interferon-alfa. 88 gener direkte relatert til funksjoner til immunceller ble oppregulert, inkludert gener involvert i antigenbehandling og presentasjon, T-celleaktivering, lymfocytthandel og effektorfunksjoner, noe som tyder på at interferon-alfa oppregulerer flere gener som involverer forskjellige aspekter av immunforsvaret responser for å øke immuniteten mot hepatitt C-virus (7).

For tiden har behandling for HCV fortsatt en betydelig ikke-responder-rate og er assosiert med bivirkninger som begrenser mange individer fra å motta behandling. Allerede molekylær profilering av DNA-mikroarrayer har identifisert potensielle genetiske mål som kan ha en rolle i patogenesen av HCV-assosiert hepatitt og enda viktigere mulige mål som har en rolle som respons på interferonbehandling. Arbeidet som foreslås her håper å bygge videre på denne kunnskapen og kan føre til forbedrede behandlingsformer for HCV.

Metoder/eksperimentell design:

Godkjenning fra Alfred Hospitals etiske komité vil bli innhentet og forsøkspersoner vil bli rekruttert via Alfred Hospitals hepatittklinikker. Informert samtykke for studien vil bli innhentet etter at formålet er forklart muntlig og via en vanlig engelsk uttalelse. Informert samtykke vil også omfatte samtykke til leverbiopsier. I første omgang vil det bli gjennomført en pilotstudie der kun ett forsøksperson vil bli rekruttert til både den eksperimentelle og kontrollarmen av studien. Når resultatene fra denne pilotstudien er analysert, vil studien utvides til å omfatte et større antall individer.

Leverbiopsier vil bli utført på følgende grupper.

1. HCV-positive pasienter før oppstart og ved slutten av behandling med enten standard eller pegylert interferon pluss ribavirin. Denne gruppen vil bli delt inn i respondere og ikke-responderer på behandling. Kjerneleverbiopsier under ultralydveiledning er allerede rutinemessig utført på denne gruppen før behandlingsstart. For formålet med denne studien er ikke-responderere på kombinasjonsterapi de individene som forblir HCV-RNA-positive ved slutten av behandlingen.
2. Kontrollpopulasjon bestående av pasienter som gjennomgår laparotomi for sykdommer som ikke involverer leveren. Disse biopsiene vil bli tatt på tidspunktet for operasjonen.

Nok levervev (ca. 1-2 mg) vil bli oppnådd til å isolere messenger RNA (mRNA) ved oligo dT kromatografi. Når det er isolert, vil mRNA bli reverstranskribert til komplementært DNA (cDNA). Dette cDNA vil deretter bli merket med et fluorescerende reportermolekyl. Hybridisering av det merkede lever-cDNA vil da skje med DNA-mikroarrayen. Det er tenkt at mikroarrayet vil bli kommersielt oppnådd og bestå av humant cDNA. Det er nok DNA på mikroarrayet til at to partier merket lever-cDNA med forskjellige fluorescerende markører (dvs. rød og grønn) kan hybridiseres til matrisen samtidig uten forstyrrelser. Følgende hybridiseringer vil da bli satt opp.

Reportermolekyl 1: HCV +ve gruppe. cDNA Reporter molekyl 2: HCV-ve gruppe. cDNA

Hybridisering 1 Responder til Rx. Før Rx Control cDNA

Hybridization 2 Responder til Rx. Etter Rx Control cDNA

Hybridisering 3 Ikke responder på Rx. Før Rx Control cDNA

Hybridisering 4 Ikke responder på Rx. Etter Rx Control cDNA

Rx = behandling.

Den hybridiserte matrisen vil deretter bli skannet og kommersielt tilgjengelige programvarepakker vil bli brukt for å hjelpe til med tolkningen av resultatene (8). Gener eller grupper av gener av spesiell interesse inkluderer:

1. Pro-inflammatoriske responsgener

   • Th-1 cytokiner som Gamma Interferon (IFN), Interleukin-2 (IL-2) og Tumor Necrosis Factor-beta (TNF-ß). Th1-cytokiner fremmer produksjon av opsoniserende antistoffer (f.eks. IgG1) og induksjon av cellulær cytotoksisitet og makrofagaktivering. Th1-responser er fremtredende i forsvaret mot patogener som replikerer intracellulært.
   • Tumor Necrosis Factor (TNF) og TNF-reseptorfamilie av molekyler som er sterkt pro-inflammatoriske og involvert i immunregulering.
   • Interleukin-12 (IL-12) som er et nøkkelcytokin som beskytter verten mot viral og mikrobiell infeksjon. Den forbinder immunsystemets medfødte og ervervede armer.
   • Interleukin-18 (IL-18) som har vist seg å virke som en kjemoattraktant.

2. Gener involvert i en pro-fibrotisk respons.

   • Transformerende vekstfaktor beta (TGFbeta) som forårsaker fibroblastproliferasjon.
   • Procollagen I og II.
   • Blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF) og PDGF beta-reseptor overekspresjon har vært knyttet til utvikling av fibrotisk sykdom så vel som kreft og åreforkalkning.
   • Matrise metalloproteinaser spiller en sentral rolle i angiogenese og har en rolle i tumorigenese.
   • Fibroblastvekstfaktor.
   • Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) som er kjent for sine angiogene egenskaper.
   • Bindevevsvekstfaktor som stimulerer kollagenproduksjonen.

I tillegg vil nye gener som tidligere ikke er identifisert, med differensiell ekspresjon bli letet etter og karakterisert.

Referanser som er relevante for dette prosjektet (fra litteratursøk)

1. Chopra, S. Behandling av kronisk hepatitt C-infeksjon: Anbefalinger. I: Up To Date, Rose, BR(Ed), Up To Date, Wellesley. MA, 2002.
2. Bonis, PLA, Chopra, S. Administrering av kombinert interferon alfa-2b og ribavirin ved behandling av hepatitt C-infeksjon. I: Up To Date, Rose, BR(Ed), Up To Date, Wellesley. MA, 2002.
3. Honda, M, Kaneko, S, Kawai, H, et al. Differensiell genuttrykk mellom kroniske hepatitt B og C leverlesjoner. Gastroenterology 2001; 120: 955-66.
4. Shackel, NA, McGuinness, PH, Abbott, CA, et al. Innsikt i patobiologien til hepatitt C-virus-assosiert cirrhose: analyse av intrahepatisk differensiell genuttrykk. Am J Pathol 2002; 160: 641-54.
5. Su, AI, Pezacki, JP, Wodicka L, et al. Genomisk analyse av vertens respons på hepatitt C-virusinfeksjon. Proc Natl Acad Sci 2002;99:15669-74.
6. Girard, S, Shalhoub, P, Lescure, P, et al. En endret cellulær respons på interferon og oppregulering av interleukin-8 indusert av hepatitt C-virusproteinet NS5A avdekket ved mikroarray-analyse. Virology 2002; 295: 272-83.
7. Ji, X, Cheung, R, Cooper, S, et al. Interferon alfa regulert genuttrykk hos pasienter som starter interferonbehandling for kronisk hepatitt C. Hepatology 2003;37:610-21.
8. Jenkins, RE, Pennington, SR. arrays for proteinekspresjonsprofilering: mot et levedyktig alternativ til todimensjonal gelelektroforese. Proteomics 2001; 1:12-29.