Pharmakogenomik der Interferon- und Ribavirin-Behandlung bei Patienten mit chronischer Hepatitis-C-Virusinfektion

Hintergrund und Forschungsplan:

Eine chronische HCV-Infektion verläuft häufig über viele Jahre hinweg fortschreitend und kann letztendlich zu einer Leberzirrhose und der Notwendigkeit einer Lebertransplantation oder eines hepatozellulären Karzinoms führen. Die Entscheidung, Patienten mit chronischer Hepatitis-C-Infektion zu behandeln, basiert auf mehreren Faktoren, darunter dem natürlichen Verlauf und dem Stadium der Erkrankung sowie der Wirksamkeit und den Nebenwirkungen der Therapie. Als allgemeine Regel gilt, dass Patienten, die für eine Behandlung in Betracht gezogen werden, histologische und virologische Anzeichen einer chronischen Infektion (d. h. HCV-RNA im Serum nachweisbar) und einen erhöhten Serum-ALT-Wert aufweisen sollten (1). Die Kombinationsbehandlung mit Interferon und Ribavirin ist derzeit die beste verfügbare Behandlung einer chronischen HCV-Infektion. Allerdings ist das Ansprechen auf die Therapie nicht optimal und es gibt mehrere Nebenwirkungen.

Zu den Nebenwirkungen, die während der Therapie von Patienten mit Interferon und Ribavirin beobachtet werden, gehören grippeähnliche Symptome, die meist auf Interferon zurückzuführen sind, Zytopenien und durch Ribavirin induzierte Hämolyse. Psychiatrische Veränderungen durch Interferon treten bei bis zu 50 % auf und therapiebedürftige Schilddrüsenanomalien treten bei etwa 1 bis 5 % der mit Interferon behandelten Patienten auf. Auch über Autoimmunerkrankungen und Netzhautblutungen wurde berichtet. Darüber hinaus ist eine Kombinationstherapie bei Patienten mit Nierenfunktionsstörungen, Herzerkrankungen und hämolytischen Anämien mit erheblichen Risiken verbunden, da die Behandlung mit Anämie verbunden sein kann. Patienten, die depressiv oder suizidgefährdet sind, sollten ebenfalls ausgeschlossen werden (2).

Bisher wurden nur wenige DNA-Microarray-Arbeiten mit HCV durchgeführt. Die geleistete Arbeit ist jedoch interessant und vielversprechend. In Studien zum Vergleich von Hepatitis B (HBV) mit Hepatitis C wurde festgestellt, dass bei einer HBV-Infektion Gene exprimiert werden, die vorwiegend an Entzündungen beteiligt sind. Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, dass bei einer HCV-Infektion entzündungshemmende Gene exprimiert werden (3). In einer anderen Studie wurde gezeigt, dass HCV-assoziierte Zirrhose durch proinflammatorische, profibrotische und proapoptotische Genexpressionsprofile gekennzeichnet ist (4).

Der Verlauf der HCV-Infektion wurde durch Genexpressionsanalyse von Leberbiopsien bei akut infizierten Schimpansen untersucht, die eine anhaltende Infektion, eine vorübergehende Virusclearance oder eine anhaltende Clearance entwickeln. Vorübergehende und anhaltende virale Clearance waren eindeutig mit der Induktion von IFN-gamma-induzierten Genen und anderen Genen verbunden, die an der Antigenverarbeitung und -präsentation sowie der adaptiven Immunantwort beteiligt sind. Die Studie deckte genomweite Transkriptionsveränderungen auf, die die Etablierung, Ausbreitung und Kontrolle einer Infektion widerspiegeln, und sie enthüllten potenziell einzigartige antivirale Programme, die mit der Beseitigung einer HCV-Infektion verbunden sind (5).

In-vitro-Studien an der menschlichen Zelllinie Huh7 haben gezeigt, dass bei der Exposition der Zellen gegenüber Interferon 50 Gene in den Kontrollklonen um mindestens das Doppelte hochreguliert wurden, während die Induktion von 9 der 50 Gene in den exprimierenden Huh7-Klonen signifikant verringert war NS5A. Es wurde festgestellt, dass die Interferon-alpha-Aktivität durch das HCV-Protein NS5A gehemmt wird. Der stärkste Effekt von NS5A auf die Interferon-Reaktion wurde beim OAS-p69-Gen mit reduzierter Expression beobachtet. Darüber hinaus zeigten Huh7-Zellen, die NS5A exprimierten, eine Hochregulierung von Interleukin-8, einem proinflammatorischen Zytokin. Als Ergebnis postulierte diese Studie einen Mechanismus für die NS5A-vermittelte Interferonresistenz (6).

In einer kürzlich durchgeführten Studie wurde ein Microarray-Genprofil von mononukleären Zellen des peripheren Blutes von Hepatitis-C-Patienten durchgeführt, die mit Interferon-alpha behandelt wurden. 88 Gene, die in direktem Zusammenhang mit den Funktionen von Immunzellen stehen, wurden hochreguliert, darunter Gene, die an der Antigenverarbeitung und -präsentation, der T-Zell-Aktivierung, dem Lymphozytentransport und Effektorfunktionen beteiligt sind, was darauf hindeutet, dass Interferon-alpha mehrere Gene hochreguliert, die verschiedene Aspekte des Immunsystems betreffen Reaktionen zur Stärkung der Immunität gegen das Hepatitis-C-Virus (7).

Derzeit weist die Behandlung von HCV immer noch eine erhebliche Non-Responder-Rate auf und ist mit Nebenwirkungen verbunden, die viele Menschen von einer Behandlung abhalten. Die molekulare Profilierung mittels DNA-Mikroarrays hat bereits potenzielle genetische Ziele identifiziert, die bei der Pathogenese der HCV-assoziierten Hepatitis eine Rolle spielen könnten, und, was noch wichtiger ist, mögliche Ziele, die bei der Reaktion auf die Behandlung mit Interferon eine Rolle spielen könnten. Die hier vorgeschlagene Arbeit soll auf diesem Wissensschatz aufbauen und möglicherweise zu verbesserten Behandlungsmodalitäten für HCV führen.

Methoden/Experimentelles Design:

Die Genehmigung der Ethikkommission des Alfred Hospital wird eingeholt und die Probanden werden über die Hepatitis-Kliniken des Alfred Hospital rekrutiert. Die Einverständniserklärung für die Studie wird eingeholt, nachdem ihr Zweck mündlich und durch eine einfache englische Erklärung erklärt wurde. Die Einverständniserklärung umfasst auch die Zustimmung zu Leberbiopsien. Zunächst wird eine Pilotstudie durchgeführt, bei der nur ein Proband sowohl für den experimentellen als auch für den Kontrollteil der Studie rekrutiert wird. Sobald die Ergebnisse dieser Pilotstudie analysiert wurden, wird die Studie auf eine größere Anzahl von Personen ausgeweitet.

Bei den folgenden Gruppen werden Leberbiopsien durchgeführt.

1. HCV-positive Patienten vor Beginn und am Ende der Behandlung mit Standard- oder pegyliertem Interferon plus Ribavirin. Diese Gruppe wird in Responder und Non-Responder auf die Behandlung unterteilt. Bei dieser Patientengruppe werden vor Behandlungsbeginn bereits routinemäßig Leberbiopsien unter Ultraschallkontrolle durchgeführt. Im Sinne dieser Studie sind Personen, die auf die Kombinationstherapie nicht ansprechen, diejenigen Personen, die am Ende der Behandlung weiterhin HCV-RNA-positiv sind.
2. Kontrollpopulation bestehend aus Patienten, die sich einer Laparotomie wegen Erkrankungen unterziehen, die nicht die Leber betreffen. Diese Biopsien würden zum Zeitpunkt der Operation entnommen.

Es wird ausreichend Lebergewebe (ca. 1–2 mg) gewonnen, um Messenger-RNA (mRNA) durch Oligo-dT-Chromatographie zu isolieren. Nach der Isolierung wird die mRNA revers in komplementäre DNA (cDNA) transkribiert. Diese cDNA wird dann mit einem fluoreszierenden Reportermolekül markiert. Anschließend erfolgt die Hybridisierung der markierten Leber-cDNA mit dem DNA-Microarray. Es ist vorgesehen, dass der Mikroarray kommerziell erhältlich ist und aus menschlicher cDNA besteht. Auf dem Microarray befindet sich genügend DNA, dass zwei Chargen markierter Leber-cDNA mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern (d. h. rot und grün) können ohne Interferenz gleichzeitig mit dem Array hybridisiert werden. Die folgenden Hybridisierungen würden dann eingerichtet.

Reportermolekül 1: HCV +ve-Gruppe. cDNA-Reportermolekül 2: HCV-ve-Gruppe. cDNA

Hybridisierung 1 Responder auf Rx. Vor Rx-Kontroll-cDNA

Hybridisierung 2-Responder auf Rx. Nach Rx-Kontroll-cDNA

Hybridisierung 3 Reagiert nicht auf Rx. Vor Rx-Kontroll-cDNA

Hybridisierung 4 Reagiert nicht auf Rx. Nach Rx-Kontroll-cDNA

Rx = Behandlung.

Das hybridisierte Array wird dann gescannt und kommerziell erhältliche Softwarepakete werden verwendet, um bei der Interpretation der Ergebnisse zu helfen (8). Zu den Genen oder Gengruppen von besonderem Interesse gehören:

1. Gene für entzündungsfördernde Reaktionen

   • Th-1-Zytokine wie Gamma-Interferon (IFN), Interleukin-2 (IL-2) und Tumornekrosefaktor-beta (TNF-ß). Th1-Zytokine fördern die Produktion opsonisierender Antikörper (z. B. IgG1) und die Induktion zellulärer Zytotoxizität und Makrophagenaktivierung. Th1-Reaktionen spielen eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Krankheitserregern, die sich intrazellulär vermehren.
   • Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) und TNF-Rezeptor-Molekülfamilie, die stark entzündungsfördernd und an der Immunregulation beteiligt ist.
   • Interleukin-12 (IL-12), ein wichtiges Zytokin, das den Wirt vor viralen und mikrobiellen Infektionen schützt. Es verbindet die angeborenen und erworbenen Arme des Immunsystems.
   • Interleukin-18 (IL-18), das nachweislich als Chemoattraktiv wirkt.

2. Gene, die an einer profibrotischen Reaktion beteiligt sind.

   • Transformierender Wachstumsfaktor Beta (TGFbeta), der die Proliferation von Fibroblasten verursacht.
   • Prokollagen I und II.
   • Die Überexpression des aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktors (PDGF) und des PDGF-Beta-Rezeptors wurde mit der Entwicklung fibrotischer Erkrankungen sowie Krebs und Arteriosklerose in Verbindung gebracht.
   • Matrix-Metalloproteinasen spielen eine zentrale Rolle bei der Angiogenese und spielen eine Rolle bei der Tumorentstehung.
   • Fibroblasten-Wachstumsfaktor.
   • Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), der für seine angiogenen Eigenschaften bekannt ist.
   • Bindegewebswachstumsfaktor, der die Kollagenproduktion stimuliert.

Darüber hinaus wird nach neuen, bisher nicht identifizierten Genen mit unterschiedlicher Expression gesucht und diese charakterisiert.

Für dieses Projekt relevante Referenzen (aus der Literaturrecherche)

1. Chopra, S. Behandlung einer chronischen Hepatitis-C-Infektion: Empfehlungen. In: Up To Date, Rose, BR(Hrsg.), Up To Date, Wellesley. MA, 2002.
2. Bonis, PLA, Chopra, S. Verabreichung von kombiniertem Interferon alfa-2b und Ribavirin bei der Behandlung einer Hepatitis-C-Infektion. In: Up To Date, Rose, BR(Hrsg.), Up To Date, Wellesley. MA, 2002.
3. Honda, M, Kaneko, S, Kawai, H, et al. Differenzielle Genexpression zwischen chronischen Hepatitis B- und C-Leberläsionen. Gastroenterologie 2001; 120: 955-66.
4. Shackel, NA, McGuinness, PH, Abbott, CA, et al. Einblicke in die Pathobiologie der Hepatitis-C-Virus-assoziierten Zirrhose: Analyse der intrahepatischen differentiellen Genexpression. Am J Pathol 2002; 160: 641-54.
5. Su, AI, Pezacki, JP, Wodicka L, et al. Genomanalyse der Wirtsreaktion auf eine Hepatitis-C-Virusinfektion. Proc Natl Acad Sci 2002;99:15669-74.
6. Girard, S., Shalhoub, P., Lescure, P. et al. Eine durch Microarray-Analyse aufgedeckte veränderte zelluläre Reaktion auf Interferon und Hochregulierung von Interleukin-8, hervorgerufen durch das Hepatitis-C-Virusprotein NS5A. Virologie 2002; 295: 272-83.
7. Ji,
8. Jenkins, RE, Pennington, SR. Arrays zur Proteinexpressionsprofilierung: Auf dem Weg zu einer praktikablen Alternative zur zweidimensionalen Gelelektrophorese. Proteomik 2001; 1: 12-29.