Farmacogenómica del tratamiento con interferón y ribavirina en pacientes con infección crónica por el virus de la hepatitis C

Antecedentes y Plan de Investigación:

La infección crónica por VHC a menudo sigue un curso progresivo durante muchos años y, en última instancia, puede provocar cirrosis y la necesidad de un trasplante de hígado o carcinoma hepatocelular. La decisión de tratar a los pacientes con infección crónica por hepatitis C se basa en varios factores que incluyen la historia natural y el estadio de la enfermedad y la eficacia y los efectos adversos relacionados con la terapia. Como regla general, los pacientes que se consideran para el tratamiento deben tener evidencia histológica y virológica de infección crónica (es decir, ARN del VHC detectable en suero) y una ALT sérica elevada (1). El tratamiento combinado con interferón y ribavirina es actualmente el mejor tratamiento disponible para la infección crónica por VHC. Sin embargo, la respuesta a la terapia es subóptima y hay varios efectos secundarios.

Los efectos secundarios observados durante el tratamiento de pacientes con interferón y ribavirina incluyen síntomas similares a los de la gripe debido principalmente al interferón, citopenias y hemólisis inducida por ribavirina. Los cambios psiquiátricos debidos al interferón ocurren hasta en un 50% y las anormalidades de la tiroides que requieren terapia ocurren en alrededor del 1 al 5% de los tratados con interferón. También se han informado enfermedades autoinmunes y hemorragias retinianas. Además, la terapia combinada está asociada con riesgos significativos en pacientes con disfunción renal, enfermedad cardíaca y anemias hemolíticas, ya que el tratamiento puede estar asociado con anemia. Los pacientes que están deprimidos o suicidas también deben ser excluidos (2).

Hasta este punto, se ha realizado poco trabajo de microarreglos de ADN con el VHC. Sin embargo, el trabajo que se ha realizado es interesante y prometedor. En estudios que compararon la hepatitis B (VHB) con la hepatitis C, se encontró que la infección por VHB expresa genes predominantemente implicados en la inflamación. Por el contrario, con la infección por VHC se encontró que se expresaban genes antiinflamatorios (3). En otro estudio, se demostró que la cirrosis asociada al VHC se caracteriza por perfiles de expresión génica proinflamatoria, profibrótica y proapoptótica (4).

Se ha examinado la progresión de la infección por VHC mediante análisis de expresión génica de biopsias de hígado en chimpancés con infección aguda que desarrollan infección persistente, eliminación viral transitoria o eliminación sostenida. La eliminación viral transitoria y sostenida se asoció únicamente con la inducción de genes inducidos por IFN-gamma y otros genes involucrados en el procesamiento y presentación de antígenos y la respuesta inmunitaria adaptativa. El estudio reveló cambios transcripcionales en todo el genoma que reflejan el establecimiento, la propagación y el control de la infección, y revelan programas antivirales potencialmente únicos asociados con la eliminación de la infección por el VHC (5).

Los estudios in vitro en la línea celular humana Huh7 han demostrado que tras la exposición de las células al Interferón 50, los genes aumentaron al menos dos veces en los clones de control, mientras que la inducción de 9 de los 50 genes se redujo significativamente en los clones Huh7 que expresan NS5A. Se ha descubierto que la actividad del interferón-alfa es inhibida por la proteína NS5A del VHC. El efecto más fuerte de NS5A sobre la respuesta de interferón se observó en el gen OAS-p69 con expresión reducida. Además, las células Huh7 que expresan NS5A mostraron una regulación positiva de la interleucina-8, una citocina proinflamatoria. Como resultado, este estudio postuló un mecanismo para la resistencia al interferón mediada por NS5A (6).

En un estudio reciente, se realizó un perfil genético de micromatrices de células mononucleares de sangre periférica de pacientes con hepatitis C tratados con interferón-alfa. 88 genes relacionados directamente con las funciones de las células inmunitarias se regularon al alza, incluidos los genes implicados en el procesamiento y la presentación de antígenos, la activación de las células T, el tráfico de linfocitos y las funciones efectoras, lo que sugiere que el interferón-alfa regula al alza múltiples genes que implican diferentes aspectos del sistema inmunitario. respuestas para mejorar la inmunidad contra el virus de la hepatitis C (7).

Actualmente, el tratamiento para el VHC todavía tiene una tasa significativa de no respondedores y está asociado con efectos secundarios que limitan que muchas personas reciban tratamiento. El perfil molecular mediante micromatrices de ADN ya ha identificado objetivos genéticos potenciales que pueden tener un papel en la patogenia de la hepatitis asociada al VHC y, lo que es más importante, posibles objetivos que tienen un papel en la respuesta al tratamiento con interferón. El trabajo propuesto aquí espera construir sobre este cuerpo de conocimiento y puede conducir a mejores modalidades de tratamiento para el VHC.

Métodos/Diseño Experimental:

Se obtendrá la aprobación del Comité de Ética del Hospital Alfred y los sujetos se reclutarán a través de las Clínicas de Hepatitis del Hospital Alfred. El consentimiento informado para el estudio se obtendrá después de que se explique su propósito verbalmente y mediante una declaración en un lenguaje sencillo. El consentimiento informado también incluirá el consentimiento para las biopsias de hígado. Inicialmente, se llevará a cabo un estudio piloto en el que solo un sujeto será reclutado tanto para el brazo experimental como para el de control del estudio. Una vez que se hayan analizado los resultados de este estudio piloto, se ampliará el estudio para abarcar a un mayor número de personas.

Se realizarán biopsias de hígado en los siguientes grupos.

1. Pacientes VHC positivos antes del comienzo y al final del tratamiento con interferón estándar o pegilado más ribavirina. Este grupo se subdividirá en respondedores y no respondedores al tratamiento. Las biopsias de núcleo hepático guiadas por ultrasonido ya se realizan de forma rutinaria en este grupo antes del comienzo del tratamiento. A los efectos de este estudio, los no respondedores a la terapia combinada son aquellos individuos que siguen siendo positivos para el ARN del VHC al final del tratamiento.
2. Población de control compuesta por pacientes sometidos a laparotomía por enfermedades que no afectan al hígado. Estas biopsias se obtendrían en el momento de la cirugía.

Se obtendrá suficiente tejido hepático (aproximadamente 1-2 mg) para aislar el ARN mensajero (ARNm) mediante cromatografía oligo dT. Una vez aislado, el ARNm se transcribirá inversamente a ADN complementario (ADNc). Este cDNA luego se marcará con una molécula indicadora fluorescente. A continuación, se producirá la hibridación del ADNc de hígado marcado con la micromatriz de ADN. Se prevé que la micromatriz se obtendrá comercialmente y consistirá en ADNc humano. Hay suficiente ADN en la micromatriz como para que dos lotes de ADNc de hígado marcados con diferentes marcadores fluorescentes (es decir, rojo y verde) se pueden hibridar con la matriz al mismo tiempo sin ninguna interferencia. Entonces se establecerían las siguientes hibridaciones.

Molécula indicadora 1: grupo HCV +ve. Molécula indicadora de ADNc 2: grupo VHC -ve. ADNc

Hibridación 1 Respondedor a Rx. Antes de Rx Control cDNA

Hibridación 2 Respondedor a Rx. Después de la prescripción de ADNc de control

Hibridación 3 No respondedor a Rx. Antes de Rx Control cDNA

Hibridación 4 No respondedor a Rx. Después de la prescripción de ADNc de control

Rx = tratamiento.

Luego se escaneará la matriz híbrida y se utilizarán paquetes de software disponibles comercialmente para ayudar en la interpretación de los resultados (8). Los genes o grupos de genes de particular interés incluyen:

1. Genes de respuesta proinflamatoria

   • Citocinas Th-1 como Interferón Gamma (IFN), Interleucina-2 (IL-2) y Factor de Necrosis Tumoral-beta (TNF-ß). Las citoquinas Th1 promueven la producción de anticuerpos opsonizantes (p. ej., IgG1) y la inducción de citotoxicidad celular y activación de macrófagos. Las respuestas Th1 son prominentes en la defensa contra patógenos que se replican intracelularmente.
   • El factor de necrosis tumoral (TNF) y la familia de moléculas receptoras de TNF que son fuertemente proinflamatorias e involucradas en la regulación inmunológica.
   • Interleucina-12 (IL-12), que es una citocina clave que protege al huésped de infecciones virales y microbianas. Vincula los brazos innatos y adquiridos del sistema inmunitario.
   • Interleucina-18 (IL-18) que se ha demostrado que actúa como quimioatrayente.

2. Genes implicados en una respuesta profibrótica.

   • Transformando el factor de crecimiento beta (TGFbeta) que causa la proliferación de fibroblastos.
   • Procolágeno I y II.
   • La sobreexpresión del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y del receptor beta de PDGF se ha relacionado con el desarrollo de la enfermedad fibrótica, así como con el cáncer y la aterosclerosis.
   • Las metaloproteinasas de matriz juegan un papel fundamental en la angiogénesis y tienen un papel en la tumorigénesis.
   • Factor de crecimiento de fibroblastos.
   • Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF) que es conocido por sus propiedades angiogénicas.
   • Factor de crecimiento del tejido conectivo que estimula la producción de colágeno.

Además, se buscarán y caracterizarán genes novedosos no identificados previamente, con expresión diferencial.

Referencias relevantes para este proyecto (de la búsqueda bibliográfica)

1. Chopra, S. Tratamiento de la infección por hepatitis C crónica: Recomendaciones. En: Al día, Rose, BR(Ed), Al día, Wellesley. MA, 2002.
2. Bonis, PLA, Chopra, S. Administración de interferón alfa-2b combinado y ribavirina en el tratamiento de la infección por hepatitis C. En: Al día, Rose, BR(Ed), Al día, Wellesley. MA, 2002.
3. Honda, M, Kaneko, S, Kawai, H, et al. Expresión génica diferencial entre lesiones hepáticas crónicas de hepatitis B y C. Gastroenterología 2001; 120: 955-66.
4. Shackel, NA, McGuinness, PH, Abbott, CA, et al. Información sobre la patobiología de la cirrosis asociada al virus de la hepatitis C: análisis de la expresión génica diferencial intrahepática. Am J Pathol 2002; 160: 641-54.
5. Su, AI, Pezacki, JP, Wodicka L, et al. Análisis genómico de la respuesta del huésped a la infección por el virus de la hepatitis C. Proc Natl Acad Sci 2002;99:15669-74.
6. Girard, S, Shalhoub, P, Lescure, P, et al. Una respuesta celular alterada al interferón y la regulación positiva de la interleucina-8 inducida por la proteína viral de la hepatitis C NS5A descubierta por análisis de micromatrices. Virología 2002; 295: 272-83.
7. Ji, X, Cheung, R, Cooper, S, et al. Expresión génica regulada por interferón alfa en pacientes que inician tratamiento con interferón para la hepatitis C crónica. Hepatología 2003;37:610-21.
8. Jenkins, RE, Pennington, SR. matrices para el perfilado de expresión de proteínas: hacia una alternativa viable a la electroforesis en gel bidimensional. Proteómica 2001; 1: 12-29.