Farmakogenomi af interferon- og ribavirinbehandling hos patienter med kronisk hepatitis C-virusinfektion

Baggrunds- og forskningsplan:

Kronisk HCV-infektion følger ofte et progressivt forløb over mange år og kan i sidste ende resultere i skrumpelever og behov for levertransplantation eller hepatocellulært karcinom. Beslutningen om at behandle patienter med kronisk hepatitis C-infektion er baseret på adskillige faktorer, herunder sygdommens naturlige historie og stadie samt virkningen og bivirkningerne i forbindelse med behandlingen. Som en generel regel bør patienter, der overvejes til behandling, have histologiske og virologiske tegn på kronisk infektion (dvs. HCV RNA påviselig i serum) og en forhøjet serum-ALAT (1). Kombinationsbehandling med Interferon og Ribavirin er i øjeblikket den bedste tilgængelige behandling for kronisk HCV-infektion. Imidlertid er respons på terapi suboptimal, og der er flere bivirkninger.

Bivirkninger set under behandling af patienter med Interferon og Ribavirin omfatter influenzalignende symptomer, hovedsagelig på grund af interferon, cytopenier og hæmolyse induceret af Ribavirin. Psykiatriske ændringer på grund af interferon forekommer hos op til 50 %, og thyroideaabnormiteter, der kræver behandling, forekommer hos omkring 1 til 5 %, der behandles med interferon. Autoimmun sygdom og nethindeblødninger er også blevet rapporteret. Derudover er kombinationsbehandling forbundet med betydelige risici hos patienter med nyreinsufficiens, hjertesygdom og hæmolytisk anæmi, da behandling kan være forbundet med anæmi. Patienter, der er deprimerede eller selvmordstruede bør også udelukkes (2).

Til dette punkt er der udført lidt DNA-mikroarray-arbejde med HCV. Men det arbejde, der er blevet udført, er interessant og lover. I undersøgelser, der sammenlignede hepatitis B (HBV) med hepatitis C, blev HBV-infektion fundet at udtrykke gener, der overvejende er involveret i inflammation. I modsætning hertil viste det sig, at antiinflammatoriske gener med HCV-infektion blev udtrykt (3). I en anden undersøgelse har HCV-associeret cirrhose vist sig at være karakteriseret ved proinflammatoriske, pro-fibrotiske og proapoptotiske genekspressionsprofiler (4).

Progressionen af ​​HCV-infektion ved genekspressionsanalyse af leverbiopsier hos akut inficerede chimpanser, der udvikler vedvarende infektion, forbigående viral clearance eller vedvarende clearance, er blevet undersøgt. Forbigående og vedvarende viral clearance var unikt forbundet med induktion af IFN-gamma-inducerede gener og andre gener involveret i antigenbehandling og -præsentation og det adaptive immunrespons. Undersøgelsen afslørede genomomspændende transkriptionelle ændringer, der afspejler etablering, spredning og kontrol af infektion, og de afslører potentielt unikke antivirale programmer forbundet med clearance af HCV-infektion (5).

In vitro undersøgelser i den humane cellelinje Huh7 har vist, at ved eksponering af cellerne for Interferon 50 blev gener opreguleret med mindst det dobbelte i kontrolkloner, hvorimod induktion af 9 af de 50 gener var signifikant reduceret i de Huh7 kloner, der udtrykker NS5A. Interferon-alfa-aktivitet har vist sig at blive hæmmet af HCV-proteinet NS5A. Den stærkeste effekt af NS5A på interferon-respons blev observeret på OAS-p69-genet med reduceret ekspression. Derudover viste Huh7-celler, der udtrykker NS5A, en opregulering af interleukin-8, et proinflammatorisk cytokin. Som et resultat postulerede denne undersøgelse en mekanisme for NS5A-medieret interferonresistens (6).

I en nylig undersøgelse blev der udført mikroarray-genprofilering af mononukleære celler fra perifert blod fra hepatitis C-patienter behandlet med interferon-alfa. 88 gener direkte relateret til funktioner af immunceller blev opreguleret, herunder gener involveret i antigenbehandling og præsentation, T-celleaktivering, lymfocyttrafik og effektorfunktioner, hvilket tyder på, at interferon-alfa opregulerer flere gener, der involverer forskellige aspekter af immunsystemet responser for at øge immuniteten mod hepatitis C-virus (7).

I øjeblikket har behandling for HCV stadig en betydelig non-responderrate og er forbundet med bivirkninger, som begrænser mange individer i at modtage behandling. Allerede molekylær profilering af DNA-mikroarrays har identificeret potentielle genetiske mål, som kan have en rolle i patogenesen af ​​HCV-associeret hepatitis og endnu vigtigere mulige mål, som har en rolle som respons på interferonbehandling. Det arbejde, der foreslås her, håber at bygge videre på denne viden og kan føre til forbedrede behandlingsmodaliteter for HCV.

Metoder/eksperimentelt design:

Godkendelse fra Alfred Hospitals etiske komité vil blive opnået, og forsøgspersoner vil blive rekrutteret via Alfred Hospitals Hepatitisklinikker. Informeret samtykke til undersøgelsen vil blive opnået, efter at formålet er forklaret mundtligt og via en almindelig engelsk erklæring. Informeret samtykke vil også omfatte samtykke til leverbiopsier. I første omgang vil der blive gennemført en pilotundersøgelse, hvor kun én forsøgsperson vil blive rekrutteret til både forsøgs- og kontroldelen af ​​undersøgelsen. Når resultaterne fra denne pilotundersøgelse er blevet analyseret, vil undersøgelsen blive udvidet til at omfatte et større antal individer.

Leverbiopsier vil blive udført på følgende grupper.

1. HCV-positive patienter før påbegyndelse og ved afslutning af behandling med enten standard eller pegyleret interferon plus ribavirin. Denne gruppe vil blive opdelt i respondere og ikke-responderende på behandling. Core leverbiopsier under ultralydsvejledning udføres allerede rutinemæssigt på denne gruppe før påbegyndelse af behandlingen. Til formålet med denne undersøgelse er ikke-responderende på kombinationsterapi de personer, som forbliver HCV-RNA-positive ved afslutningen af ​​behandlingen.
2. Kontrolpopulation bestående af patienter, der gennemgår laparotomi for sygdomme, der ikke involverer leveren. Disse biopsier ville blive opnået på tidspunktet for operationen.

Der opnås nok levervæv (ca. 1-2 mg) til at isolere messenger RNA (mRNA) ved oligo dT kromatografi. Når først det er isoleret, vil mRNA'et blive omvendt transskriberet til komplementært DNA (cDNA). Dette cDNA vil derefter blive mærket med et fluorescerende reportermolekyle. Hybridisering af det mærkede lever-cDNA vil derefter ske med DNA-mikroarrayet. Det forudses, at mikroarrayet vil blive opnået kommercielt og bestå af humant cDNA. Der er nok DNA på mikroarrayet til at to partier af mærket lever-cDNA med forskellige fluorescerende markører (dvs. rød og grøn) kan hybridiseres til arrayet på samme tid uden nogen interferens. De følgende hybridiseringer ville derefter blive sat op.

Reporter molekyle 1: HCV +ve gruppe. cDNA Reporter molekyle 2: HCV-ve gruppe. cDNA

Hybridisering 1 Responder til Rx. Før Rx kontrol cDNA

Hybridization 2 Responder til Rx. Efter Rx kontrol cDNA

Hybridisering 3 Ikke reagerer på Rx. Før Rx kontrol cDNA

Hybridisering 4 Ikke reagerer på Rx. Efter Rx kontrol cDNA

Rx = behandling.

Det hybridiserede array vil derefter blive scannet, og kommercielt tilgængelige softwarepakker vil blive brugt til at hjælpe med fortolkningen af ​​resultaterne (8). Gener eller grupper af gener af særlig interesse omfatter:

1. Pro-inflammatoriske responsgener

   • Th-1 cytokiner såsom Gamma Interferon (IFN), Interleukin-2 (IL-2) og Tumor Necrosis Factor-beta (TNF-ß). Th1-cytokiner fremmer produktionen af ​​opsoniserende antistoffer (f.eks. IgG1) og induktion af cellulær cytotoksicitet og makrofagaktivering. Th1-reaktioner er fremtrædende i forsvaret mod patogener, som replikerer intracellulært.
   • Tumor Necrosis Factor (TNF) og TNF-receptorfamilie af molekyler, som er stærkt pro-inflammatoriske og involveret i immunregulering.
   • Interleukin-12 (IL-12), som er et nøglecytokin, der beskytter værten mod viral og mikrobiel infektion. Det forbinder immunsystemets medfødte og erhvervede arme.
   • Interleukin-18 (IL-18), som har vist sig at virke som et kemoattraktant.

2. Gener involveret i en pro-fibrotisk reaktion.

   • Transformerende vækstfaktor beta (TGFbeta), som forårsager fibroblastproliferation.
   • Procollagen I og II.
   • Blodplade-afledt vækstfaktor (PDGF) og PDGF beta-receptor overekspression er blevet forbundet med udvikling af fibrotisk sygdom såvel som cancer og åreforkalkning.
   • Matrix metalloproteinaser spiller en central rolle i angiogenese og har en rolle i tumorgenese.
   • Fibroblast vækstfaktor.
   • Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), som er kendt for sine angiogene egenskaber.
   • Bindevævsvækstfaktor som stimulerer kollagenproduktionen.

Derudover vil der blive ledt efter nye gener, der tidligere var uidentificeret, med differentiel ekspression, og de vil blive karakteriseret.

Referencer, der er relevante for dette projekt (fra litteratursøgning)

1. Chopra, S. Behandling af kronisk hepatitis C-infektion: anbefalinger. I: Up To Date, Rose, BR(Ed), Up To Date, Wellesley. MA, 2002.
2. Bonis, PLA, Chopra, S. Administration af kombineret interferon alfa-2b og ribavirin til behandling af hepatitis C-infektion. I: Up To Date, Rose, BR(Ed), Up To Date, Wellesley. MA, 2002.
3. Honda, M, Kaneko, S, Kawai, H, et al. Differentiel genekspression mellem kronisk hepatitis B og C leverlæsioner. Gastroenterologi 2001; 120: 955-66.
4. Shackel, NA, McGuinness, PH, Abbott, CA, et al. Indsigt i patobiologien af ​​hepatitis C-virus-associeret cirrhose: analyse af intrahepatisk differentiel genekspression. Am J Pathol 2002; 160: 641-54.
5. Su, AI, Pezacki, JP, Wodicka L, et al. Genomisk analyse af værtens respons på hepatitis C-virusinfektion. Proc Natl Acad Sci 2002;99:15669-74.
6. Girard, S, Shalhoub, P, Lescure, P, et al. Et ændret cellulært respons på interferon og opregulering af interleukin-8 induceret af hepatitis C-virusproteinet NS5A afdækket ved mikroarray-analyse. Virology 2002; 295: 272-83.
7. Ji, X, Cheung, R, Cooper, S, et al. Interferon alfa reguleret genekspression hos patienter, der påbegynder interferonbehandling for kronisk hepatitis C. Hepatology 2003;37:610-21.
8. Jenkins, RE, Pennington, SR. arrays til proteinekspressionsprofilering: mod et levedygtigt alternativ til todimensionel gelelektroforese. Proteomics 2001; 1:12-29.