만성 C형 간염 바이러스 감염 환자에서 인터페론과 리바비린 치료의 약물유전체학

배경 및 연구 계획:

만성 HCV 감염은 종종 수년에 걸쳐 진행되는 과정을 따르며 궁극적으로 간경화 및 간 이식 또는 간세포 암종의 필요성을 초래할 수 있습니다. 만성 C형 간염 환자의 치료에 대한 결정은 질병의 자연 경과 및 병기, 치료와 관련된 효능 및 부작용을 포함한 여러 요인을 기반으로 합니다. 일반적으로 치료를 고려하는 환자는 만성 감염의 조직학적 및 바이러스학적 증거(즉, 혈청에서 검출 가능한 HCV RNA)와 혈청 ALT 상승이 있어야 합니다(1). 인터페론과 리바비린의 병용 치료는 현재 만성 HCV 감염에 사용할 수 있는 최상의 치료법입니다. 그러나 치료에 대한 반응은 최적이 아니며 몇 가지 부작용이 있습니다.

인터페론과 리바비린으로 치료하는 동안 나타나는 부작용으로는 주로 인터페론으로 인한 독감 유사 증상, 혈구감소증, 리바비린에 의해 유도된 용혈 등이 있습니다. 인터페론으로 인한 정신과적 변화는 최대 50%에서 발생하며 치료가 필요한 갑상선 이상은 인터페론으로 치료된 약 1~5%에서 발생합니다. 자가면역 질환과 망막 출혈도 보고되었습니다. 또한 병용 요법은 치료가 빈혈과 관련될 수 있으므로 신장 기능 장애, 심장 질환 및 용혈성 빈혈이 있는 환자에서 상당한 위험과 관련이 있습니다. 우울하거나 자살하려는 환자도 제외해야 합니다(2).

지금까지 HCV에 대한 DNA 마이크로어레이 작업은 거의 이루어지지 않았습니다. 그러나 수행된 작업은 흥미롭고 가능성을 보여줍니다. B형 간염(HBV)과 C형 간염을 비교한 연구에서 HBV 감염은 주로 염증과 관련된 유전자를 발현하는 것으로 밝혀졌습니다. 대조적으로, HCV 감염의 경우 항염증 유전자가 발현되는 것으로 밝혀졌습니다(3). 또 다른 연구에서 HCV 관련 간경변증은 전염증성, 전섬유화 및 세포사멸 유발 유전자 발현 프로필을 특징으로 하는 것으로 나타났습니다(4).

지속적인 감염, 일시적인 바이러스 제거 또는 지속적인 제거를 나타내는 급성 감염된 침팬지의 간 생검의 유전자 발현 분석에 의한 HCV 감염의 진행이 조사되었습니다. 일시적이고 지속적인 바이러스 제거는 IFN-감마 유발 유전자 및 항원 처리 및 제시와 적응 면역 반응에 관련된 다른 유전자의 유도와 고유하게 연관되어 있습니다. 이 연구는 감염의 확립, 확산 및 통제를 반영하는 게놈 차원의 전사적 변화를 밝혀냈고, HCV 감염 제거와 관련된 잠재적으로 독특한 항바이러스 프로그램을 밝혀냈습니다(5).

인간 세포주 Huh7에 대한 체외 연구는 세포가 인터페론에 노출되면 대조군 클론에서 적어도 2배 이상 상향 조절되는 반면, 50개 유전자 중 9개 유전자의 유도는 NS5A. 인터페론-알파 활성은 HCV 단백질 NS5A에 의해 억제되는 것으로 밝혀졌습니다. 인터페론 반응에 대한 NS5A의 가장 강력한 효과는 발현이 감소된 OAS-p69 유전자에서 관찰되었습니다. 또한, NS5A를 발현하는 Huh7 세포는 전염증성 사이토카인인 인터루킨-8의 상향 조절을 보였다. 결과적으로 이 연구는 NS5A 매개 인터페론 내성에 대한 메커니즘을 가정했습니다(6).

최근 연구에서 인터페론-알파로 치료받은 C형 간염 환자의 말초 혈액 단핵 세포의 마이크로어레이 유전자 프로파일링이 수행되었습니다. 항원 처리 및 제시, T 세포 활성화, 림프구 트래피킹 및 이펙터 기능에 관련된 유전자를 포함하여 면역 세포의 기능과 직접적으로 관련된 88개의 유전자가 상향 조절되었으며, 이는 인터페론-알파가 면역의 다양한 측면을 포함하는 여러 유전자를 상향 조절함을 시사합니다. C형 간염 바이러스에 대한 면역 강화 반응(7).

현재, HCV에 대한 치료는 여전히 상당한 비반응자 비율을 가지며 많은 개인이 치료를 받는 것을 제한하는 부작용과 관련이 있습니다. DNA 마이크로어레이에 의한 분자 프로파일링은 이미 HCV 관련 간염의 병인에서 역할을 할 수 있는 잠재적인 유전적 표적과 더 중요하게는 인터페론 치료에 대한 반응에서 역할을 하는 가능한 표적을 확인했습니다. 여기에서 제안된 작업은 이러한 지식 체계를 기반으로 하여 HCV에 대한 개선된 치료 양식으로 이어질 수 있기를 희망합니다.

방법/실험 설계:

알프레드 병원 윤리 위원회의 승인을 받고 피험자는 알프레드 병원의 간염 클리닉을 통해 모집합니다. 연구에 대한 정보에 입각한 동의는 그 목적이 구두로 그리고 평이한 영어 진술을 통해 설명된 후에 얻어질 것입니다. 정보에 입각한 동의에는 간 생검에 대한 동의도 포함됩니다. 처음에는 연구의 실험 부문과 통제 부문 모두에 한 명의 피험자만 모집하는 파일럿 연구가 수행될 것입니다. 이 파일럿 연구의 결과가 분석되면 더 많은 수의 개인을 포함하도록 연구를 확장할 것입니다.

간 생검은 다음 그룹에서 수행됩니다.

1. 표준 또는 페길화된 인터페론 + 리바비린으로 치료를 시작하기 전 및 치료가 끝날 때 HCV 양성 환자. 이 그룹은 치료에 대한 반응자와 비반응자로 세분됩니다. 치료를 시작하기 전에 이 그룹에 대해 초음파 유도하에 핵심 간 생검을 이미 일상적으로 수행했습니다. 이 연구의 목적을 위해 병용 요법에 대한 비반응자는 치료 종료 시 HCV-RNA 양성을 유지하는 개인입니다.
2. 간과 관련되지 않은 질병에 대해 개복술을 받는 환자로 구성된 대조 집단. 이러한 생검은 수술 시에 얻어집니다.

oligo dT 크로마토그래피로 메신저 RNA(mRNA)를 분리하기에 충분한 간 조직(약 1-2mg)을 얻을 수 있습니다. 분리되면 mRNA는 상보적 DNA(cDNA)로 역전사됩니다. 이 cDNA는 형광 리포터 분자로 표시됩니다. 표지된 간 cDNA의 혼성화는 DNA 마이크로어레이와 함께 발생합니다. 마이크로어레이는 시판되고 인간 cDNA로 구성될 것으로 예상됩니다. 서로 다른 형광 마커(즉, 빨강 및 녹색) 간섭 없이 어레이에 동시에 혼성화할 수 있습니다. 그런 다음 다음 혼성화가 설정됩니다.

리포터 분자 1: HCV +ve 그룹. cDNA 리포터 분자 2: HCV -ve 그룹. cDNA

혼성화 1 Rx에 대한 응답자. Rx 제어 cDNA 전

혼성화 2 Rx에 대한 응답자. Rx 컨트롤 cDNA 후

혼성화 3 Rx에 대한 무응답자. Rx 제어 cDNA 전

혼성화 4 Rx에 대한 무응답자. Rx 컨트롤 cDNA 후

Rx = 치료.

그런 다음 혼성화된 어레이를 스캔하고 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어 패키지를 사용하여 결과 해석을 돕습니다(8). 특정 관심 유전자 또는 유전자 그룹은 다음과 같습니다.

1. 전 염증 반응 유전자

   • 감마 인터페론(IFN), 인터루킨-2(IL-2) 및 종양 괴사 인자-베타(TNF-ß)와 같은 Th-1 사이토카인. Th1 사이토카인은 옵소닌화 항체(예: IgG1)의 생성과 세포 독성 및 대식세포 활성화 유도를 촉진합니다. Th1 반응은 세포 내에서 복제되는 병원체에 대한 방어에서 두드러집니다.
   • TNF(Tumor Necrosis Factor) 및 TNF 수용체 계열의 분자는 강력한 친염증성이며 면역 조절에 관여합니다.
   • 인터루킨-12(IL-12)는 바이러스 및 미생물 감염으로부터 숙주를 보호하는 핵심 사이토카인입니다. 그것은 면역계의 선천적 팔과 후천적 팔을 연결합니다.
   • 인터루킨-18(IL-18)은 화학유인물질로 작용하는 것으로 나타났습니다.

2. 친 섬유화 반응에 관여하는 유전자.

   • 섬유아세포 증식을 유발하는 변형 성장 인자 베타(TGFbeta).
   • 프로콜라겐 I 및 II.
   • 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 및 PDGF 베타 수용체 과발현은 섬유성 질환 및 암 및 죽상동맥경화증의 발병과 관련이 있습니다.
   • 매트릭스 금속단백분해효소는 혈관신생에서 중추적인 역할을 하고 종양형성에서 역할을 합니다.
   • 섬유아세포 성장 인자.
   • 혈관 신생 특성으로 알려진 혈관 내피 성장 인자(VEGF).
   • 콜라겐 생성을 자극하는 결합 조직 성장 인자.

또한, 이전에 확인되지 않았으며 차등 발현되는 새로운 유전자를 찾고 특성화할 것입니다.

이 프로젝트와 관련된 참조(문헌 검색에서)

1. Chopra, S. 만성 C형 간염 감염 치료: 권장 사항. In: Up To Date, Rose, BR(Ed), Up To Date, Wellesley. 매사추세츠, 2002.
2. Bonis, PLA, Chopra, S. C형 간염 감염 치료에 인터페론 알파-2b와 리바비린을 병용 투여. In: Up To Date, Rose, BR(Ed), Up To Date, Wellesley. 매사추세츠, 2002.
3. Honda, M, Kaneko, S, Kawai, H 등. 만성 B형 간염과 C형 간염 병변 사이의 차등 유전자 발현. Gastroenterology 2001; 120: 955-66.
4. Shackel, NA, McGuinness, PH, Abbott, CA 등. C 형 간염 바이러스 관련 간경변의 병리학에 대한 통찰력 : 간내 차등 유전자 발현 분석. Am J Pathol 2002; 160: 641-54.
5. Su, AI, Pezacki, JP, Wodicka L, 외. C형 간염 바이러스 감염에 대한 숙주 반응의 게놈 분석. Proc Natl Acad Sci 2002;99:15669-74.
6. Girard, S, Shalhoub, P, Lescure, P, 외. 인터페론에 대한 변경된 세포 반응 및 C형 간염 바이러스 단백질 NS5A에 의해 유도된 인터루킨-8의 상향 조절은 마이크로어레이 분석에 의해 발견되지 않았습니다. 바이러스학 2002; 295: 272-83.
7. Ji, X, Cheung, R, Cooper, S, et al. 만성 C형 간염에 대한 인터페론 치료를 시작한 환자에서 인터페론 알파 조절 유전자 발현. Hepatology 2003;37:610-21.
8. Jenkins, RE, Pennington, SR. 단백질 발현 프로파일링을 위한 어레이: 2차원 겔 전기영동에 대한 실행 가능한 대안을 향하여. Proteomics 2001; 1: 12-29.