Фармакогеномика терапии интерфероном и рибавирином у больных с хронической вирусной инфекцией гепатита С

Предыстория и план исследования:

Хроническая инфекция ВГС часто имеет прогрессирующее течение в течение многих лет и может в конечном итоге привести к циррозу печени и необходимости трансплантации печени или гепатоцеллюлярной карциноме. Решение о лечении пациентов с хроническим гепатитом С зависит от нескольких факторов, включая естественное течение и стадию заболевания, а также эффективность и побочные эффекты, связанные с терапией. Как правило, пациенты, которым назначено лечение, должны иметь гистологические и вирусологические признаки хронической инфекции (т. Комбинированное лечение интерфероном и рибавирином в настоящее время является лучшим доступным методом лечения хронической инфекции ВГС. Тем не менее, ответ на терапию является субоптимальным, и есть несколько побочных эффектов.

Побочные эффекты, наблюдаемые при лечении пациентов интерфероном и рибавирином, включают гриппоподобные симптомы, в основном из-за интерферона, цитопению и гемолиз, вызванный рибавирином. Психические изменения, вызванные интерфероном, возникают у 50% пациентов, а аномалии щитовидной железы, требующие терапии, возникают примерно у 1-5% пациентов, получающих интерферон. Также сообщалось об аутоиммунных заболеваниях и кровоизлияниях в сетчатку. Кроме того, комбинированная терапия связана со значительным риском у пациентов с почечной дисфункцией, сердечными заболеваниями и гемолитической анемией, поскольку лечение может быть связано с анемией. Следует также исключить пациентов с депрессией или суицидальными наклонностями (2).

К этому моменту для ВГС была проделана небольшая работа с ДНК-микрочипами. Однако то, что было проделано, интересно и многообещающе. В исследованиях, сравнивающих гепатит B (HBV) с гепатитом C, было обнаружено, что инфекция HBV экспрессирует гены, преимущественно участвующие в воспалении. Напротив, при ВГС-инфекции экспрессируются противовоспалительные гены (3). В другом исследовании было показано, что цирроз, ассоциированный с ВГС, характеризуется профилями провоспалительной, профибротической и проапоптотической экспрессии генов (4).

Было исследовано прогрессирование инфекции HCV с помощью анализа экспрессии генов в биоптатах печени остро инфицированных шимпанзе, у которых развилась персистирующая инфекция, транзиторная или устойчивая элиминация вируса. Временная и устойчивая элиминация вируса была однозначно связана с индукцией генов, индуцированных интерфероном-гамма, и других генов, участвующих в процессинге и презентации антигена, а также в адаптивном иммунном ответе. Исследование выявило полногеномные транскрипционные изменения, которые отражают возникновение, распространение и контроль инфекции, а также выявили потенциально уникальные противовирусные программы, связанные с элиминацией ВГС-инфекции (5).

Исследования in vitro на клеточной линии человека Huh7 показали, что при воздействии на клетки интерфероном 50 гены активировались по крайней мере в два раза в контрольных клонах, тогда как индукция 9 из 50 генов была значительно снижена в тех клонах Huh7, экспрессирующих НС5А. Было обнаружено, что активность интерферона-альфа ингибируется белком ВГС NS5A. Наиболее сильный эффект NS5A на интерфероновый ответ наблюдался в отношении гена OAS-p69 со сниженной экспрессией. Кроме того, клетки Huh7, экспрессирующие NS5A, показали активацию интерлейкина-8, провоспалительного цитокина. В результате этого исследования был постулирован механизм опосредованной NS5A резистентности к интерферону (6).

В недавнем исследовании было выполнено микрочиповое профилирование генов мононуклеарных клеток периферической крови пациентов с гепатитом С, получавших интерферон-альфа. Активировались 88 генов, непосредственно связанных с функциями иммунных клеток, включая гены, участвующие в процессинге и презентации антигена, активации Т-клеток, переносе лимфоцитов и эффекторных функциях. реакции на повышение иммунитета против вируса гепатита С (7).

В настоящее время лечение ВГС по-прежнему имеет значительный уровень неэффективности и связано с побочными эффектами, которые ограничивают получение лечения многими людьми. Уже молекулярное профилирование с помощью ДНК-микрочипов выявило потенциальные генетические мишени, которые могут играть роль в патогенезе гепатита, ассоциированного с ВГС, и, что более важно, возможные мишени, которые играют роль в ответ на лечение интерфероном. Предлагаемая здесь работа надеется опираться на эту совокупность знаний и может привести к улучшению методов лечения ВГС.

Методы/план эксперимента:

Будет получено одобрение Комитета по этике больницы Альфреда, и субъекты будут набраны через клиники по лечению гепатита в больнице Альфреда. Информированное согласие на исследование будет получено после того, как его цель будет объяснена в устной форме и на простом английском языке. Информированное согласие также будет включать согласие на биопсию печени. Первоначально будет проведено пилотное исследование, в котором только один субъект будет набран как в экспериментальную, так и в контрольную группы исследования. Как только результаты этого экспериментального исследования будут проанализированы, исследование будет расширено, чтобы охватить большее количество людей.

Биопсия печени будет выполнена в следующих группах.

1. ВГС-положительные пациенты до начала и в конце лечения либо стандартным, либо пегилированным интерфероном плюс рибавирином. Эта группа будет подразделяться на ответивших и не ответивших на лечение. Пункционная биопсия печени под ультразвуковым контролем уже регулярно проводится в этой группе до начала лечения. Для целей данного исследования не ответившими на комбинированную терапию являются лица, у которых к концу лечения сохраняется положительная реакция на РНК ВГС.
2. Контрольная популяция, состоящая из пациентов, перенесших лапаротомию по поводу заболеваний, не связанных с печенью. Эти биопсии будут получены во время операции.

Будет получено достаточно ткани печени (примерно 1-2 мг) для выделения матричной РНК (мРНК) с помощью олиго-dT-хроматографии. После выделения мРНК будет обратно транскрибирована в комплементарную ДНК (кДНК). Эта кДНК затем будет помечена флуоресцентной репортерной молекулой. Затем будет происходить гибридизация меченой кДНК печени с ДНК-микрочипом. Предполагается, что микрочип будет коммерчески получен и будет состоять из кДНК человека. На микрочипе достаточно ДНК, чтобы две партии кДНК печени пометили разными флуоресцентными маркерами (т.е. красный и зеленый) могут быть гибридизированы с массивом одновременно без каких-либо помех. Затем будут установлены следующие гибридизации.

Репортерная молекула 1: HCV +ve группа. кДНК репортерной молекулы 2: группа HCV -ve. кДНК

Гибридизация 1 ответчик на Rx. Перед контрольной кДНК Rx

Гибридизация 2 Ответчик на Rx. кДНК после контроля Rx

Гибридизация 3 Не отвечает на Rx. Перед контрольной кДНК Rx

Гибридизация 4 Не отвечает на Rx. кДНК после контроля Rx

Rx = лечение.

Затем гибридизированный массив будет просканирован, и для интерпретации результатов будут использованы коммерчески доступные пакеты программного обеспечения (8). Гены или группы генов, представляющие особый интерес, включают:

1. Гены провоспалительного ответа

   • Цитокины Th-1, такие как гамма-интерферон (IFN), интерлейкин-2 (IL-2) и фактор некроза опухоли-бета (TNF-ß). Цитокины Th1 способствуют выработке опсонизирующих антител (например, IgG1) и индукции клеточной цитотоксичности и активации макрофагов. Ответы Th1 играют важную роль в защите от патогенов, которые реплицируются внутриклеточно.
   • Фактор некроза опухоли (TNF) и семейство молекул рецептора TNF, которые сильно провоспалительны и участвуют в иммунной регуляции.
   • Интерлейкин-12 (IL-12), который является ключевым цитокином, защищающим хозяина от вирусных и микробных инфекций. Он связывает врожденные и приобретенные ветви иммунной системы.
   • Интерлейкин-18 (IL-18), который, как было показано, действует как хемоаттрактант.

2. Гены, участвующие в профиброзной реакции.

   • Трансформирующий фактор роста бета (TGFbeta), вызывающий пролиферацию фибробластов.
   • Проколлаген I и II.
   • Сверхэкспрессия тромбоцитарного фактора роста (PDGF) и бета-рецептора PDGF связана с развитием фиброзного заболевания, а также рака и атеросклероза.
   • Матриксные металлопротеиназы играют ключевую роль в ангиогенезе и играют роль в онкогенезе.
   • Фактор роста фибробластов.
   • Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), известный своими ангиогенными свойствами.
   • Фактор роста соединительной ткани, стимулирующий выработку коллагена.

Кроме того, будут искать и охарактеризовывать новые гены, ранее не идентифицированные, с дифференциальной экспрессией.

Ссылки, относящиеся к этому проекту (из поиска литературы)

1. Чопра, С. Лечение хронического гепатита С: рекомендации. В: В курсе, Роуз, BR (Ed), В курсе, Уэлсли. Массачусетс, 2002.
2. Bonis, PLA, Chopra, S. Введение комбинированного интерферона альфа-2b и рибавирина при лечении инфекции гепатита С. В: В курсе, Роуз, BR (Ed), В курсе, Уэлсли. Массачусетс, 2002.
3. Хонда М., Канеко С., Каваи Х. и др. Дифференциальная экспрессия генов между хроническими поражениями печени гепатита В и С. Гастроэнтерология 2001; 120: 955-66.
4. Шакель, Н.А., МакГиннесс, П.Х., Эбботт, Калифорния, и соавт. Взгляд на патобиологию цирроза печени, ассоциированного с вирусом гепатита С: анализ внутрипеченочной дифференциальной экспрессии генов. Ам Дж. Патол, 2002 г.; 160: 641-54.
5. Su, AI, Pezacki, JP, Wodicka L, et al. Геномный анализ ответа хозяина на инфекцию вирусом гепатита С. Proc Natl Acad Sci 2002; 99: 15669-74.
6. Жирар С., Шалхуб П., Лескюр П. и др. Измененный клеточный ответ на интерферон и повышающая регуляция интерлейкина-8, индуцированная белком вируса гепатита С NS5A, обнаруженная микрочиповым анализом. Вирусология 2002; 295: 272-83.
7. Ji, X, Cheung, R, Cooper, S, et al. Альфа-интерферон регулирует экспрессию генов у пациентов, начинающих лечение интерфероном хронического гепатита C. Hepatology 2003; 37: 610-21.
8. Дженкинс, RE, Пеннингтон, SR. массивы для профилирования экспрессии белков: на пути к жизнеспособной альтернативе двумерному гель-электрофорезу. Протеомика 2001; 1: 12-29.