Farmakogenomika leczenia interferonem i rybawiryną u pacjentów z przewlekłym zakażeniem wirusem zapalenia wątroby typu C

Tło i plan badań:

Przewlekłe zakażenie HCV często ma postępujący przebieg przez wiele lat i może ostatecznie doprowadzić do marskości i konieczności przeszczepienia wątroby lub raka wątrobowokomórkowego. Decyzja o leczeniu pacjentów z przewlekłym wirusowym zapaleniem wątroby typu C opiera się na kilku czynnikach, w tym naturalnym przebiegu i stadium choroby oraz skuteczności i działaniach niepożądanych związanych z terapią. Zasadniczo pacjenci, u których rozważa się leczenie, powinni mieć histologiczne i wirusologiczne dowody przewlekłego zakażenia (tj. HCV RNA wykrywalne w surowicy) oraz podwyższoną aktywność AlAT w surowicy (1). Leczenie skojarzone interferonem i rybawiryną jest obecnie najlepszą dostępną metodą leczenia przewlekłego zakażenia HCV. Jednak odpowiedź na terapię jest suboptymalna i występuje kilka skutków ubocznych.

Działania niepożądane obserwowane podczas leczenia pacjentów interferonem i rybawiryną obejmują objawy grypopodobne, głównie spowodowane interferonem, cytopenie i hemolizę wywołaną przez rybawirynę. Zmiany psychiczne spowodowane interferonem występują nawet u 50%, a nieprawidłowości tarczycy wymagające leczenia u około 1 do 5% leczonych interferonem. Zgłaszano również choroby autoimmunologiczne i krwotoki siatkówkowe. Ponadto terapia skojarzona wiąże się ze znacznym ryzykiem u pacjentów z zaburzeniami czynności nerek, chorobami serca i niedokrwistością hemolityczną, ponieważ leczenie może być związane z niedokrwistością. Należy również wykluczyć pacjentów z depresją lub skłonnościami samobójczymi (2).

Do tej pory wykonano niewiele prac nad mikromacierzami DNA z HCV. Jednak to, co zostało wykonane, jest interesujące i obiecujące. W badaniach porównujących wirusowe zapalenie wątroby typu B (HBV) z wirusowym zapaleniem wątroby typu C stwierdzono, że zakażenie HBV powoduje ekspresję genów związanych głównie ze stanem zapalnym. Natomiast w przypadku zakażenia HCV stwierdzono ekspresję genów przeciwzapalnych (3). W innym badaniu wykazano, że marskość wątroby związana z zakażeniem HCV charakteryzuje się profilami ekspresji genów prozapalnymi, profibrotycznymi i proapoptotycznymi (4).

Zbadano postęp zakażenia HCV na podstawie analizy ekspresji genów biopsji wątroby u ostro zakażonych szympansów, u których rozwinęła się trwała infekcja, przejściowy klirens wirusowy lub trwały klirens. Przejściowe i utrzymujące się usuwanie wirusa było jednoznacznie związane z indukcją genów indukowanych przez IFN-gamma i innych genów zaangażowanych w przetwarzanie i prezentację antygenu oraz adaptacyjną odpowiedź immunologiczną. Badanie ujawniło zmiany transkrypcyjne w całym genomie, które odzwierciedlają ustanowienie, rozprzestrzenianie się i kontrolę infekcji, i ujawniają potencjalnie unikalne programy antywirusowe związane z usuwaniem infekcji HCV (5).

Badania in vitro na ludzkiej linii komórkowej Huh7 wykazały, że po ekspozycji komórek na interferon 50 geny ulegały co najmniej dwukrotnej regulacji w klonach kontrolnych, podczas gdy indukcja 9 z 50 genów była znacznie zmniejszona w tych klonach Huh7 wyrażających NS5A. Stwierdzono, że aktywność interferonu alfa jest hamowana przez białko NS5A HCV. Najsilniejszy wpływ NS5A na odpowiedź interferonową zaobserwowano na genie OAS-p69 o obniżonej ekspresji. Ponadto komórki Huh7 wykazujące ekspresję NS5A wykazywały regulację w górę interleukiny-8, cytokiny prozapalnej. W rezultacie badanie to postulowało mechanizm oporności na interferon, w której pośredniczy NS5A (6).

W niedawnym badaniu przeprowadzono mikromacierzowe profilowanie genowe jednojądrzastych komórek krwi obwodowej pacjentów z wirusowym zapaleniem wątroby typu C leczonych interferonem-alfa. Zwiększono aktywność 88 genów bezpośrednio związanych z funkcjami komórek odpornościowych, w tym genów zaangażowanych w przetwarzanie i prezentację antygenu, aktywację komórek T, transport limfocytów i funkcje efektorowe, co sugeruje, że interferon-alfa reguluje w górę wiele genów obejmujących różne aspekty odpowiedzi immunologicznej. odpowiedzi zwiększające odporność przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C (7).

Obecnie leczenie HCV nadal charakteryzuje się znacznym odsetkiem osób niereagujących na leczenie i wiąże się z działaniami niepożądanymi, co ogranicza możliwość leczenia wielu osób. Już profilowanie molekularne za pomocą mikromacierzy DNA zidentyfikowało potencjalne cele genetyczne, które mogą odgrywać rolę w patogenezie zapalenia wątroby związanego z HCV i, co ważniejsze, możliwe cele, które odgrywają rolę w odpowiedzi na leczenie interferonem. Proponowane tutaj prace mają opierać się na tej wiedzy i mogą prowadzić do ulepszonych metod leczenia HCV.

Metody/Projekt eksperymentu:

Uzyskana zostanie zgoda Komitetu Etyki Szpitala Alfred, a pacjenci będą rekrutowani za pośrednictwem klinik zapalenia wątroby Szpitala Alfred. Świadoma zgoda na badanie zostanie uzyskana po ustnym wyjaśnieniu celu badania i wyrażeniu go prostym angielskim oświadczeniem. Świadoma zgoda obejmuje również zgodę na biopsje wątroby. Początkowo zostanie przeprowadzone badanie pilotażowe, w którym tylko jeden uczestnik zostanie zwerbowany zarówno do eksperymentalnej, jak i kontrolnej części badania. Po przeanalizowaniu wyników tego badania pilotażowego badanie zostanie rozszerzone, aby objąć większą liczbę osób.

Biopsje wątroby zostaną wykonane na następujących grupach.

1. Pacjenci zakażeni wirusem HCV przed rozpoczęciem i na końcu leczenia standardowym lub pegylowanym interferonem z rybawiryną. Ta grupa zostanie podzielona na osoby reagujące i niereagujące na leczenie. Biopsje gruboigłowe wątroby pod kontrolą USG są już rutynowo wykonywane w tej grupie przed rozpoczęciem leczenia. Dla celów tego badania osoby niereagujące na terapię skojarzoną to te osoby, które pozostają HCV-RNA dodatnie na koniec leczenia.
2. Populacja kontrolna składająca się z pacjentów poddawanych laparotomii z powodu chorób niezwiązanych z wątrobą. Te biopsje byłyby uzyskiwane w czasie operacji.

Uzyskana zostanie wystarczająca ilość tkanki wątroby (około 1-2 mg) do wyizolowania informacyjnego RNA (mRNA) za pomocą chromatografii oligo dT. Po wyizolowaniu mRNA ulegnie odwrotnej transkrypcji do komplementarnego DNA (cDNA). Ten cDNA będzie następnie znakowany fluorescencyjną cząsteczką reporterową. Następnie nastąpi hybrydyzacja znakowanego cDNA wątroby z mikromacierzą DNA. Przewiduje się, że mikromacierz będzie dostępna w handlu i będzie składać się z ludzkiego cDNA. Na mikromacierzy jest wystarczająco dużo DNA, aby dwie partie znakowanego cDNA wątroby różnymi markerami fluorescencyjnymi (tj. czerwony i zielony) można hybrydyzować z macierzą w tym samym czasie bez żadnych zakłóceń. Następnie zostaną utworzone następujące hybrydyzacje.

Cząsteczka reporterowa 1: grupa HCV +ve. Cząsteczka cDNA Reporter 2: grupa HCV-ve. cDNA

Hybrydyzacja 1 Odpowiadająca na Rx. Przed kontrolnym cDNA Rx

Hybrydyzacja 2 Odpowiadająca na Rx. Po kontroli cDNA Rx

Hybrydyzacja 3 Brak odpowiedzi na Rx. Przed kontrolnym cDNA Rx

Hybrydyzacja 4 Brak odpowiedzi na Rx. Po kontroli cDNA Rx

Rx = leczenie.

Zhybrydyzowana macierz zostanie następnie zeskanowana, a dostępne na rynku pakiety oprogramowania zostaną wykorzystane do pomocy w interpretacji wyników (8). Geny lub grupy genów o szczególnym znaczeniu obejmują:

1. Geny odpowiedzi prozapalnej

   • Cytokiny Th-1, takie jak interferon gamma (IFN), interleukina-2 (IL-2) i czynnik martwicy nowotworów beta (TNF-ß). Cytokiny Th1 sprzyjają wytwarzaniu przeciwciał opsonizujących (np. IgG1) oraz indukcji cytotoksyczności komórkowej i aktywacji makrofagów. Odpowiedzi Th1 są widoczne w obronie przed patogenami, które replikują się wewnątrzkomórkowo.
   • Czynnik martwicy nowotworów (TNF) i rodzina receptorów TNF, które są silnie prozapalne i zaangażowane w regulację immunologiczną.
   • Interleukina-12 (IL-12), która jest kluczową cytokiną chroniącą gospodarza przed infekcją wirusową i bakteryjną. Łączy wrodzone i nabyte ramiona układu odpornościowego.
   • Interleukina-18 (IL-18), która, jak wykazano, działa jako chemoatraktant.

2. Geny zaangażowane w odpowiedź profibrotyczną.

   • Transformujący czynnik wzrostu beta (TGFbeta), który powoduje proliferację fibroblastów.
   • Prokolagen I i II.
   • Płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF) i nadekspresja receptora PDGF beta zostały powiązane z rozwojem choroby zwłóknieniowej, jak również raka i miażdżycy tętnic.
   • Metaloproteinazy macierzy odgrywają kluczową rolę w angiogenezie i odgrywają rolę w nowotworzeniu.
   • Czynnik wzrostu fibroblastów.
   • Czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), który jest znany ze swoich właściwości angiogennych.
   • Czynnik wzrostu tkanki łącznej, który stymuluje produkcję kolagenu.

Ponadto poszukiwane i scharakteryzowane zostaną nowe geny, wcześniej niezidentyfikowane, o zróżnicowanej ekspresji.

Odnośniki dotyczące tego projektu (z wyszukiwania literatury)

1. Chopra, S. Leczenie przewlekłego zapalenia wątroby typu C: zalecenia. W: Aktualne, Rose, BR (red.), Aktualne, Wellesley. MA, 2002.
2. Bonis, PLA, Chopra, S. Podawanie połączonego interferonu alfa-2b i rybawiryny w leczeniu zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C. W: Aktualne, Rose, BR (red.), Aktualne, Wellesley. MA, 2002.
3. Honda, M, Kaneko, S, Kawai, H, et al. Różnicowa ekspresja genów między przewlekłymi zmianami wątroby typu B i C. Gastroenterologia 2001; 120: 955-66.
4. Shackel, NA, McGuinness, PH, Abbott, CA i in. Wgląd w patobiologię marskości wątroby związanej z wirusem zapalenia wątroby typu C: analiza różnicowej ekspresji genów wewnątrzwątrobowych. Am J Pathol 2002; 160: 641-54.
5. Su, AI, Pezacki, JP, Wodicka L, et al. Analiza genomowa odpowiedzi gospodarza na zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu C. Proc Natl Acad Sci 2002;99:15669-74.
6. Girard, S, Shalhoub, P, Lescure, P, et al. Zmieniona odpowiedź komórkowa na interferon i regulacja w górę interleukiny-8 indukowana przez białko wirusa zapalenia wątroby typu C NS5A odkryta za pomocą analizy mikromacierzy. Wirusologia 2002; 295: 272-83.
7. Ji, X, Cheung, R, Cooper, S i in. Interferon alfa reguluje ekspresję genów u pacjentów rozpoczynających leczenie interferonem w przypadku przewlekłego wirusowego zapalenia wątroby typu C. Hepatology 2003;37:610-21.
8. Jenkins, RE, Pennington, SR. macierze do profilowania ekspresji białek: w kierunku realnej alternatywy dla dwuwymiarowej elektroforezy żelowej. Proteomika 2001; 1:12-29.