Farmacogenômica do tratamento com interferon e ribavirina em pacientes com infecção crônica pelo vírus da hepatite C

Plano de fundo e pesquisa:

A infecção crônica pelo HCV geralmente segue um curso progressivo ao longo de muitos anos e pode resultar em cirrose e na necessidade de transplante de fígado ou carcinoma hepatocelular. A decisão de tratar pacientes com infecção crônica por hepatite C é baseada em vários fatores, incluindo a história natural e estágio da doença e a eficácia e efeitos adversos relacionados à terapia. Como regra geral, os pacientes considerados para tratamento devem apresentar evidência histológica e virológica de infecção crônica (isto é, RNA do VHC detectável no soro) e elevação da ALT sérica (1). O tratamento combinado com Interferon e Ribavirina é atualmente o melhor tratamento disponível para infecção crônica por HCV. No entanto, a resposta à terapia é insatisfatória e há vários efeitos colaterais.

Os efeitos secundários observados durante o tratamento de doentes com Interferão e Ribavirina incluem sintomas gripais principalmente devidos ao interferão, citopenias e hemólise induzida por Ribavirina. Alterações psiquiátricas devido ao interferon ocorrem em até 50% e anormalidades da tireoide que requerem terapia ocorrem em cerca de 1 a 5% dos tratados com interferon. Doença autoimune e hemorragias retinianas também foram relatadas. Além disso, a terapia combinada está associada a riscos significativos em pacientes com disfunção renal, doença cardíaca e anemias hemolíticas, pois o tratamento pode estar associado à anemia. Pacientes deprimidos ou suicidas também devem ser excluídos (2).

Até este ponto, pouco trabalho de microarray de DNA foi feito com HCV. No entanto, o trabalho que foi feito é interessante e promissor. Em estudos comparando Hepatite B (HBV) com Hepatite C, verificou-se que a infecção por HBV expressa genes predominantemente envolvidos na inflamação. Em contraste, com a infecção por HCV, os genes anti-inflamatórios foram expressos (3). Em outro estudo, a cirrose associada ao VHC demonstrou ser caracterizada por perfis de expressão gênica pró-inflamatória, pró-fibrótica e pró-apoptótica (4).

Foi examinada a progressão da infecção por HCV pela análise da expressão gênica de biópsias hepáticas em chimpanzés com infecção aguda que desenvolvem infecção persistente, eliminação viral transitória ou eliminação sustentada. A eliminação viral transitória e sustentada foi exclusivamente associada à indução de genes induzidos por IFN-gama e outros genes envolvidos no processamento e apresentação de antígenos e na resposta imune adaptativa. O estudo revelou alterações transcricionais em todo o genoma que refletem o estabelecimento, disseminação e controle da infecção, e revelam programas antivirais potencialmente únicos associados à eliminação da infecção pelo HCV (5).

Estudos in vitro na linha celular humana Huh7 mostraram que, na exposição das células ao Interferon 50, os genes foram regulados positivamente em pelo menos duas vezes nos clones de controle, enquanto a indução de 9 dos 50 genes foi significativamente reduzida nos clones Huh7 que expressam NS5A. Verificou-se que a atividade do interferon-alfa é inibida pela proteína NS5A do VHC. O efeito mais forte de NS5A na resposta do Interferon foi observado no gene OAS-p69 com expressão reduzida. Além disso, as células Huh7 que expressam NS5A mostraram uma regulação positiva da interleucina-8, uma citocina pró-inflamatória. Como resultado, este estudo postulou um mecanismo para a resistência ao interferon mediada por NS5A (6).

Em um estudo recente, foi realizado o perfil genético de microarray de células mononucleares do sangue periférico de pacientes com hepatite C tratados com interferon-alfa. 88 genes diretamente relacionados às funções das células imunes foram regulados positivamente, incluindo genes envolvidos no processamento e apresentação de antígenos, ativação de células T, tráfico de linfócitos e funções efetoras, sugerindo que o Interferon-alfa regula positivamente múltiplos genes envolvendo diferentes aspectos do sistema imunológico respostas para aumentar a imunidade contra o vírus da hepatite C (7).

Atualmente, o tratamento para HCV ainda tem uma taxa significativa de não resposta e está associado a efeitos colaterais que limitam muitos indivíduos de receber tratamento. Já o perfil molecular por microarranjos de DNA identificou potenciais alvos genéticos que podem ter um papel na patogênese da hepatite associada ao HCV e, mais importante, possíveis alvos que têm um papel na resposta ao tratamento com interferon. O trabalho aqui proposto espera desenvolver esse corpo de conhecimento e pode levar a melhores modalidades de tratamento para HCV.

Métodos/Design Experimental:

A aprovação do Comitê de Ética do Hospital Alfred será obtida e os indivíduos serão recrutados por meio das Clínicas de Hepatite do Hospital Alfred. O consentimento informado para o estudo será obtido depois que seu objetivo for explicado verbalmente e por meio de uma declaração simples em inglês. O consentimento informado também incluirá consentimento para biópsias hepáticas. Inicialmente, será realizado um estudo piloto no qual apenas um sujeito será recrutado para o braço experimental e controle do estudo. Uma vez analisados ​​os resultados deste estudo piloto, o estudo será ampliado para abranger um número maior de indivíduos.

As biópsias hepáticas serão realizadas nos seguintes grupos.

1. Pacientes VHC positivos antes do início e no final do tratamento com interferon padrão ou peguilado mais ribavirina. Este grupo será subdividido em respondedores e não respondedores ao tratamento. Core biópsias hepáticas guiadas por ultrassom já são rotineiramente realizadas neste grupo antes do início do tratamento. Para o propósito deste estudo, não respondedores à terapia de combinação são aqueles indivíduos que permanecem positivos para HCV-RNA no final do tratamento.
2. População de controle composta por pacientes submetidos à laparotomia por doenças que não envolvem o fígado. Essas biópsias seriam obtidas no momento da cirurgia.

Tecido hepático suficiente (aproximadamente 1-2 mg) será obtido para isolar o RNA mensageiro (mRNA) por cromatografia oligo dT. Uma vez isolado, o mRNA será transcrito reversamente para DNA complementar (cDNA). Este cDNA será então marcado com uma molécula repórter fluorescente. A hibridização do cDNA de fígado marcado ocorrerá então com o microarranjo de DNA. Prevê-se que o microarray seja obtido comercialmente e consista em cDNA humano. Há DNA suficiente no microarray para que dois lotes de cDNA hepático marcado com diferentes marcadores fluorescentes (ou seja, vermelho e verde) podem ser hibridizados ao array ao mesmo tempo sem qualquer interferência. As seguintes hibridizações seriam então estabelecidas.

Molécula repórter 1: grupo HCV +ve. Molécula 2 do cDNA Reporter: grupo HCV -ve. cDNA

Hibridização 1 Respondente a Rx. Antes do cDNA de controle Rx

Hibridização 2 Respondente a Rx. Após cDNA de controle Rx

Hibridização 3 Não responde a Rx. Antes do cDNA de controle Rx

Hibridização 4 Não responde a Rx. Após cDNA de controle Rx

Rx = tratamento.

A matriz hibridizada será então digitalizada e pacotes de software disponíveis comercialmente serão usados ​​para ajudar na interpretação dos resultados (8). Genes ou grupos de genes de interesse particular incluem:

1. Genes de resposta pró-inflamatória

   • Citocinas Th-1 como Gama Interferon (IFN), Interleucina-2 (IL-2) e Fator de Necrose Tumoral-beta (TNF-ß). As citocinas Th1 promovem a produção de anticorpos opsonizantes (por exemplo, IgG1) e indução de citotoxicidade celular e ativação de macrófagos. As respostas Th1 são proeminentes na defesa contra patógenos que se replicam intracelularmente.
   • Fator de necrose tumoral (TNF) e família de moléculas de receptores de TNF que são fortemente pró-inflamatórias e envolvidas na regulação imune.
   • Interleucina-12 (IL-12), que é uma citocina chave que protege o hospedeiro de infecções virais e microbianas. Ele liga os braços inatos e adquiridos do sistema imunológico.
   • Interleucina-18 (IL-18), que demonstrou atuar como um quimioatraente.

2. Genes envolvidos em uma resposta pró-fibrótica.

   • Transformando o fator de crescimento beta (TGFbeta) que causa a proliferação de fibroblastos.
   • Procolágeno I e II.
   • O fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e a superexpressão do receptor PDGF beta têm sido associados ao desenvolvimento de doença fibrótica, bem como câncer e aterosclerose.
   • As metaloproteinases de matriz desempenham um papel central na angiogênese e têm um papel na tumorigênese.
   • Fator de crescimento de fibroblastos.
   • Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), que é conhecido por suas propriedades angiogênicas.
   • Fator de crescimento do tecido conjuntivo que estimula a produção de colágeno.

Além disso, novos genes não identificados previamente, com expressão diferencial serão procurados e caracterizados.

Referências relevantes para este projeto (da pesquisa bibliográfica)

1. Chopra, S. Tratamento da infecção crônica por hepatite C: Recomendações. In: Up To Date, Rose, BR(Ed), Up To Date, Wellesley. MA, 2002.
2. Bonis, PLA, Chopra, S. Administração de interferon alfa-2b combinado e ribavirina no tratamento da infecção por hepatite C. In: Up To Date, Rose, BR(Ed), Up To Date, Wellesley. MA, 2002.
3. Honda, M, Kaneko, S, Kawai, H, e outros. Expressão gênica diferencial entre lesões hepáticas crônicas das hepatites B e C. Gastroenterologia 2001; 120: 955-66.
4. Shackel, NA, McGuinness, PH, Abbott, CA, et al. Insights sobre a patobiologia da cirrose associada ao vírus da hepatite C: análise da expressão gênica diferencial intra-hepática. Am J Pathol 2002; 160: 641-54.
5. Su, AI, Pezacki, JP, Wodicka L, et al. Análise genômica da resposta do hospedeiro à infecção pelo vírus da hepatite C. Proc Natl Acad Sci 2002;99:15669-74.
6. Girard, S, Shalhoub, P, Lescure, P, et al. Uma resposta celular alterada ao interferon e regulação positiva da interleucina-8 induzida pela proteína viral NS5A da hepatite C descoberta por análise de microarray. Virologia 2002; 295: 272-83.
7. Ji, X, Cheung, R, Cooper, S, et al.Interferon alfa regulou a expressão gênica em pacientes iniciando tratamento com interferon para hepatite C crônica. Hepatology 2003;37:610-21.
8. Jenkins, RE, Pennington, SR. Arrays para perfis de expressão de proteínas: rumo a uma alternativa viável à eletroforese em gel bidimensional. Proteômica 2001; 1: 12-29.