Farmakogenomika léčby interferonem a ribavirinem u pacientů s chronickou infekcí virem hepatitidy C

Pozadí a plán výzkumu:

Chronická HCV infekce má často progresivní průběh po mnoho let a může nakonec vyústit v cirhózu a nutnost transplantace jater nebo hepatocelulárního karcinomu. Rozhodnutí léčit pacienty s chronickou infekcí hepatitidou C je založeno na několika faktorech včetně přirozené anamnézy a stadia onemocnění a účinnosti a nežádoucích účinků souvisejících s terapií. Obecným pravidlem je, že pacienti, u kterých se uvažuje o léčbě, by měli mít histologické a virologické známky chronické infekce (tj. HCV RNA detekovatelnou v séru) a zvýšenou sérovou ALT (1). Kombinovaná léčba interferonem a ribavirinem je v současnosti nejlepší dostupnou léčbou chronické infekce HCV. Odpověď na terapii je však suboptimální a existuje několik vedlejších účinků.

Nežádoucí účinky pozorované během léčby pacientů interferonem a ribavirinem zahrnují příznaky podobné chřipce, většinou způsobené interferonem, cytopenie a hemolýzu vyvolanou ribavirinem. Psychiatrické změny způsobené interferonem se vyskytují až u 50 % a abnormality štítné žlázy vyžadující terapii se vyskytují asi u 1 až 5 % léčených interferonem. Bylo také hlášeno autoimunitní onemocnění a retinální krvácení. Kromě toho je kombinovaná léčba spojena s významnými riziky u pacientů s renální dysfunkcí, srdečním onemocněním a hemolytickými anémií, protože léčba může být spojena s anémií. Pacienti s depresí nebo sebevražednými sklony by také měli být vyloučeni (2).

Do této chvíle bylo s HCV provedeno jen málo práce na mikročipu DNA. To, co bylo odvedeno, je však zajímavé a slibné. Ve studiích porovnávajících hepatitidu B (HBV) s hepatitidou C bylo zjištěno, že infekce HBV exprimuje geny, které se převážně podílejí na zánětu. Naproti tomu při infekci HCV bylo zjištěno, že jsou exprimovány protizánětlivé geny (3). V jiné studii bylo prokázáno, že cirhóza spojená s HCV je charakterizována prozánětlivými, profibrotickými a proapoptotickými profily genové exprese (4).

Byla zkoumána progrese infekce HCV analýzou genové exprese jaterních biopsií u akutně infikovaných šimpanzů, u kterých se rozvine perzistentní infekce, přechodná virová clearance nebo trvalá clearance. Přechodná a trvalá virová clearance byla jednoznačně spojena s indukcí genů indukovaných IFN-gama a dalších genů zapojených do zpracování a prezentace antigenu a adaptivní imunitní reakce. Studie odhalila transkripční změny v celém genomu, které odrážejí vznik, šíření a kontrolu infekce, a odhalují potenciálně unikátní antivirové programy spojené s odstraněním infekce HCV (5).

Studie in vitro na lidské buněčné linii Huh7 ukázaly, že při expozici buněk interferonu byly geny 50 up-regulovány alespoň dvojnásobně v kontrolních klonech, zatímco indukce 9 z 50 genů byla významně snížena u těch klonů Huh7 exprimujících NS5A. Bylo zjištěno, že aktivita interferonu-alfa je inhibována HCV proteinem NS5A. Nejsilnější účinek NS5A na interferonovou odpověď byl pozorován u genu OAS-p69 se sníženou expresí. Kromě toho buňky Huh7 exprimující NS5A vykazovaly up-regulaci interleukinu-8, prozánětlivého cytokinu. V důsledku toho tato studie předpokládala mechanismus pro rezistenci na interferon zprostředkovanou NS5A (6).

V nedávné studii bylo provedeno mikročipové genové profilování mononukleárních buněk periferní krve pacientů s hepatitidou C léčených interferonem-alfa. Bylo upregulováno 88 genů přímo souvisejících s funkcemi imunitních buněk, včetně genů zapojených do zpracování a prezentace antigenu, aktivace T-buněk, přenosu lymfocytů a efektorových funkcí, což naznačuje, že interferon-alfa up-reguluje více genů zahrnujících různé aspekty imunitního systému. reakce na posílení imunity proti viru hepatitidy C (7).

V současné době má léčba HCV stále významný podíl pacientů, kteří nereagují, a je spojena s vedlejšími účinky, které omezují mnoho jedinců v léčbě. Již molekulární profilování pomocí DNA microarrays identifikovalo potenciální genetické cíle, které mohou mít roli v patogenezi HCV-asociované hepatitidy, a co je důležitější, možné cíle, které hrají roli v odpovědi na léčbu interferonem. Zde navrhovaná práce doufá, že bude stavět na tomto souboru znalostí a může vést ke zlepšení léčebných modalit pro HCV.

Metody/experimentální design:

Bude získán souhlas Etické komise nemocnice Alfred a subjekty budou přijímány prostřednictvím klinik hepatitidy nemocnice Alfred. Informovaný souhlas se studií bude získán poté, co bude její účel vysvětlen slovně a prostřednictvím jednoduchého anglického prohlášení. Informovaný souhlas bude zahrnovat také souhlas s biopsií jater. Zpočátku bude provedena pilotní studie, ve které bude do experimentální i kontrolní části studie přijat pouze jeden subjekt. Jakmile budou výsledky této pilotní studie analyzovány, bude studie rozšířena tak, aby zahrnovala větší počet jednotlivců.

U následujících skupin budou provedeny jaterní biopsie.

1. HCV pozitivní pacienti před zahájením a na konci léčby buď standardním nebo pegylovaným interferonem plus Ribavirin. Tato skupina bude rozdělena na osoby, které reagují na léčbu a nereagují na léčbu. U této skupiny se již před zahájením léčby běžně provádějí jádrové jaterní biopsie pod ultrazvukovým vedením. Pro účely této studie jsou nereagujícími na kombinovanou terapii ti jedinci, kteří zůstávají HCV-RNA pozitivní na konci léčby.
2. Kontrolní populace sestávající z pacientů podstupujících laparotomii pro onemocnění nezahrnující játra. Tyto biopsie by byly získány v době operace.

Získá se dostatek jaterní tkáně (přibližně 1-2 mg) k izolaci messenger RNA (mRNA) pomocí oligo dT chromatografie. Po izolaci bude mRNA reverzně transkribována na komplementární DNA (cDNA). Tato cDNA bude poté označena fluorescenční reportérovou molekulou. Hybridizace značené jaterní cDNA pak nastane s DNA microarray. Předpokládá se, že mikročip bude komerčně získán a bude sestávat z lidské cDNA. Na mikročipu je dostatek DNA, že dvě šarže značené jaterní cDNA s různými fluorescenčními markery (tj. červená a zelená) lze hybridizovat s polem současně bez jakéhokoli rušení. Potom by byly nastaveny následující hybridizace.

Reportérová molekula 1: HCV kladná skupina. cDNA reportérová molekula 2: HCV záporná skupina. cDNA

Hybridizace 1 Responder na Rx. Před Rx kontrolní cDNA

Hybridizace 2 Responder na Rx. Po kontrolní cDNA Rx

Hybridizace 3 Nereagující na Rx. Před Rx kontrolní cDNA

Hybridizace 4 Nereagující na Rx. Po kontrolní cDNA Rx

Rx = léčba.

Hybridizované pole bude poté naskenováno a budou použity komerčně dostupné softwarové balíčky, které pomohou při interpretaci výsledků (8). Mezi geny nebo skupiny genů zvláštního zájmu patří:

1. Geny prozánětlivé odpovědi

   • Th-1 cytokiny, jako je gama interferon (IFN), interleukin-2 (IL-2) a tumor nekrotizující faktor-beta (TNF-ß). Th1 cytokiny podporují produkci opsonizačních protilátek (např. IgG1) a indukci buněčné cytotoxicity a aktivace makrofágů. Th1 reakce jsou prominentní v obraně proti patogenům, které se replikují intracelulárně.
   • Tumor Necrosis Factor (TNF) a rodina molekul TNF receptorů, které jsou silně prozánětlivé a účastní se imunitní regulace.
   • Interleukin-12 (IL-12), což je klíčový cytokin, který chrání hostitele před virovou a mikrobiální infekcí. Spojuje vrozené a získané paže imunitního systému.
   • Interleukin-18 (IL-18), u kterého bylo prokázáno, že působí jako chemoatraktant.

2. Geny zapojené do profibrotické odpovědi.

   • Transformující růstový faktor beta (TGFbeta), který způsobuje proliferaci fibroblastů.
   • Prokolagen I a II.
   • Nadměrná exprese růstového faktoru odvozeného z krevních destiček (PDGF) a PDGF beta receptoru je spojována s rozvojem fibrotického onemocnění, stejně jako rakoviny a aterosklerózy.
   • Matrixové metaloproteinázy hrají klíčovou roli v angiogenezi a mají roli v tumorigenezi.
   • Fibroblastový růstový faktor.
   • Vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF), který je známý pro své angiogenní vlastnosti.
   • Růstový faktor pojivové tkáně, který stimuluje produkci kolagenu.

Kromě toho budou hledány a charakterizovány nové geny dříve neidentifikované s rozdílnou expresí.

Reference relevantní k tomuto projektu (z literární rešerše)

1. Chopra, S. Léčba chronické infekce hepatitidou C: Doporučení. In: Aktuální, Rose, BR(Ed), Aktuální, Wellesley. MA, 2002.
2. Bonis, PLA, Chopra, S. Podávání kombinovaného interferonu alfa-2b a ribavirinu v léčbě infekce hepatitidou C. In: Aktuální, Rose, BR(Ed), Aktuální, Wellesley. MA, 2002.
3. Honda, M, Kaneko, S, Kawai, H a kol. Diferenciální genová exprese mezi chronickými jaterními lézemi hepatitidy B a C. Gastroenterology 2001; 120: 955-66.
4. Shackel, NA, McGuinness, PH, Abbott, CA, a kol. Pohledy do patobiologie cirhózy spojené s virem hepatitidy C: analýza intrahepatální diferenciální genové exprese. Am J Pathol 2002; 160: 641-54.
5. Su, AI, Pezacki, JP, Wodicka L, et al. Genomická analýza reakce hostitele na infekci virem hepatitidy C. Proč Natl Acad Sci 2002;99:15669-74.
6. Girard, S, Shalhoub, P, Lescure, P, a kol. Změněná buněčná odpověď na interferon a up-regulace interleukinu-8 indukovaná virovým proteinem hepatitidy C NS5A odhalená analýzou microarray. Virologie 2002; 295: 272-83.
7. Ji, X, Cheung, R, Cooper, S, et al. Interferon alfa reguloval genovou expresi u pacientů zahajujících léčbu chronické hepatitidy C interferonem. Hepatology 2003;37:610-21.
8. Jenkins, RE, Pennington, SR. čipy pro profilování proteinové exprese: směrem k životaschopné alternativě k dvourozměrné gelové elektroforéze. Proteomics 2001; 1: 12-29.