Interferoni- ja ribaviriinihoidon farmakogenomiikka potilailla, joilla on krooninen hepatiitti C -virusinfektio

Tausta ja tutkimussuunnitelma:

Krooninen HCV-infektio etenee usein useiden vuosien ajan ja voi lopulta johtaa kirroosiin ja maksansiirron tarpeeseen tai hepatosellulaariseen karsinoomaan. Päätös kroonista hepatiitti C -infektiota sairastavien potilaiden hoitamisesta perustuu useisiin tekijöihin, mukaan lukien taudin luonnollinen historia ja vaihe sekä hoidon tehokkuus ja haittavaikutukset. Yleissääntönä on, että potilailla, joille harkitaan hoitoa, tulee olla histologisia ja virologisia todisteita kroonisesta infektiosta (eli HCV RNA:ta havaittava seerumista) ja kohonnut seerumin ALT-arvo (1). Interferonin ja ribaviriinin yhdistelmähoito on tällä hetkellä paras saatavilla oleva hoito krooniseen HCV-infektioon. Hoitovaste ei kuitenkaan ole optimaalinen, ja sillä on useita sivuvaikutuksia.

Interferoni- ja ribaviriinihoidon aikana havaittuja haittavaikutuksia ovat flunssan kaltaiset oireet, jotka johtuvat pääasiassa interferonista, sytopeniat ja ribaviriinin aiheuttama hemolyysi. Interferonin aiheuttamia psykiatrisia muutoksia esiintyy jopa 50 %:lla ja hoitoa vaativia kilpirauhasen poikkeavuuksia noin 1–5 %:lla interferonilla hoidetuista. Myös autoimmuunisairauksia ja verkkokalvon verenvuotoja on raportoitu. Lisäksi yhdistelmähoitoon liittyy merkittäviä riskejä potilailla, joilla on munuaisten vajaatoiminta, sydänsairaus ja hemolyyttinen anemia, koska hoito voi liittyä anemiaan. Potilaat, jotka ovat masentuneita tai itsetuhoisia, tulee myös sulkea pois (2).

Tähän mennessä HCV:n kanssa on tehty vain vähän DNA-mikrosirutyötä. Tehty on kuitenkin mielenkiintoista ja lupaavaa. Tutkimuksissa, joissa verrattiin hepatiitti B:tä (HBV) hepatiitti C:hen, HBV-infektion havaittiin ilmentävän geenejä, jotka ovat pääasiassa mukana tulehduksessa. Sitä vastoin HCV-infektion yhteydessä anti-inflammatoristen geenien havaittiin ilmentyvän (3). Toisessa tutkimuksessa HCV:hen liittyvälle kirroosille on osoitettu olevan luonteenomaisia ​​proinflammatorisia, profibroottisia ja proapoptoottisia geeniekspressioprofiileja (4).

HCV-infektion etenemistä maksabiopsioiden geeniekspressioanalyysillä akuutisti tartunnan saaneilla simpansseilla, joille kehittyy jatkuva infektio, ohimenevä viruspuhdistuma tai jatkuva puhdistuma on tutkittu. Ohimenevä ja pitkäkestoinen viruksen puhdistuma liittyi ainutlaatuisesti IFN-gamma-indusoitujen geenien ja muiden antigeenin prosessointiin ja esittelyyn sekä adaptiiviseen immuunivasteeseen osallistuvien geenien induktioon. Tutkimus paljasti genominlaajuiset transkription muutokset, jotka heijastavat infektion muodostumista, leviämistä ja hallintaa, ja ne paljastavat mahdollisesti ainutlaatuisia antiviraalisia ohjelmia, jotka liittyvät HCV-infektion puhdistumiseen (5).

In vitro -tutkimukset ihmisen solulinjalla Huh7 ovat osoittaneet, että kun solut altistettiin interferonille, 50-geenit lisääntyivät vähintään kaksinkertaisesti kontrolliklooneissa, kun taas 9:n 50 geenistä induktio väheni merkittävästi niissä Huh7-klooneissa, jotka ilmensivät. NS5A. HCV-proteiinin NS5A on havaittu estävän interferoni-alfa-aktiivisuutta. NS5A:n voimakkain vaikutus interferonivasteeseen havaittiin OAS-p69-geenissä vähentyneen ilmentymisen kanssa. Lisäksi NS5A:ta ilmentävät Huh7-solut osoittivat interleukiini-8:n, proinflammatorisen sytokiinin, lisääntynyttä säätelyä. Tämän seurauksena tämä tutkimus olettaa mekanismin NS5A-välitteiselle interferoniresistenssille (6).

Äskettäisessä tutkimuksessa suoritettiin interferoni-alfalla hoidettujen hepatiitti C -potilaiden perifeerisen veren mononukleaarisolujen microarray-geeniprofilointi. 88 geeniä, jotka liittyvät suoraan immuunisolujen toimintoihin, säädeltiin ylöspäin, mukaan lukien geenit, jotka osallistuvat antigeenien käsittelyyn ja esittelyyn, T-solujen aktivaatioon, lymfosyyttien kauppaan ja efektoritoimintoihin, mikä viittaa siihen, että interferoni-alfa säätelee useita geenejä, joihin liittyy immuunijärjestelmän eri puolia. vasteet immuniteetin parantamiseksi hepatiitti C -virusta vastaan ​​(7).

Tällä hetkellä HCV:n hoidossa on edelleen merkittävä ei-vaste, ja siihen liittyy sivuvaikutuksia, jotka rajoittavat monia henkilöitä saamasta hoitoa. Jo DNA-mikrosirujen molekyyliprofilointi on tunnistanut mahdollisia geneettisiä kohteita, joilla voi olla rooli HCV:hen liittyvän hepatiitin patogeneesissä, ja mikä tärkeämpää, mahdollisia kohteita, joilla on rooli vasteessa interferonihoitoon. Tässä ehdotetussa työssä toivotaan perustuvan tähän tietoon ja se voi johtaa HCV:n hoitomenetelmien parantamiseen.

Menetelmät/kokeellinen suunnittelu:

Alfred Hospitalin eettisen toimikunnan hyväksyntä hankitaan ja tutkittavat rekrytoidaan Alfred Hospitalin hepatiittiklinikan kautta. Tietoinen suostumus tutkimukseen saadaan, kun sen tarkoitus on selitetty suullisesti ja selkeällä englanninkielisellä lausunnolla. Tietoinen suostumus sisältää myös suostumuksen maksabiopsiaa varten. Aluksi toteutetaan pilottitutkimus, jossa vain yksi koehenkilö rekrytoidaan sekä kokeelliseen että vertailuryhmään. Kun tämän pilottitutkimuksen tulokset on analysoitu, tutkimusta laajennetaan kattamaan suurempi määrä yksilöitä.

Maksabiopsiat suoritetaan seuraaville ryhmille.

1. HCV-positiiviset potilaat ennen joko standardi- tai pegyloidun interferonin ja ribaviriinin hoidon aloittamista ja sen lopussa. Tämä ryhmä jaetaan hoitoon reagoiviin ja ei-vasteisiin. Tälle ryhmälle tehdään jo rutiininomaisesti maksan ydinbiopsiat ultraääniohjauksessa ennen hoidon aloittamista. Tässä tutkimuksessa yhdistelmähoitoon reagoimattomia ovat henkilöt, jotka pysyvät HCV-RNA-positiivisina hoidon lopussa.
2. Kontrollipopulaatio, joka koostuu potilaista, joille tehdään laparotomia sellaisten sairauksien vuoksi, joihin ei liity maksaa. Nämä biopsiat otettaisiin leikkauksen yhteydessä.

Maksakudosta (noin 1-2 mg) saadaan riittävästi lähetti-RNA:n (mRNA) eristämiseksi oligo-dT-kromatografialla. Kun mRNA on eristetty, se käänteiskopioituu komplementaariseksi DNA:ksi (cDNA). Tämä cDNA leimataan sitten fluoresoivalla reportterimolekyylillä. Leimatun maksan cDNA:n hybridisaatio tapahtuu sitten DNA-mikrosirun kanssa. Odotetaan, että mikrosiru saadaan kaupallisesti ja se koostuu ihmisen cDNA:sta. Mikrosirussa on tarpeeksi DNA:ta, että kaksi erää leimattua maksan cDNA:ta erilaisilla fluoresoivilla markkereilla (ts. punainen ja vihreä) voidaan hybridisoida taulukkoon samanaikaisesti ilman häiriöitä. Seuraavat hybridisaatiot muodostettaisiin sitten.

Reportterimolekyyli 1: HCV +ve -ryhmä. cDNA-reportterimolekyyli 2: HCV-ve-ryhmä. cDNA

Hybridisaatio 1 Responder to Rx. Ennen Rx Control -cDNA:ta

Hybridisaatio 2 Responder to Rx. Rx Control -cDNA:n jälkeen

Hybridisaatio 3 Ei reagoi Rx:ään. Ennen Rx Control -cDNA:ta

Hybridisaatio 4 Ei reagoi Rx:ään. Rx Control -cDNA:n jälkeen

Rx = hoito.

Sitten hybridisoitu matriisi skannataan ja kaupallisesti saatavilla olevia ohjelmistopaketteja käytetään tulosten tulkinnassa (8). Erityisen kiinnostavia geenejä tai geeniryhmiä ovat:

1. Pro-inflammatoriset vastegeenit

   • Th-1-sytokiinit, kuten gammainterferoni (IFN), interleukiini-2 (IL-2) ja tuumorinekroositekijä-beta (TNF-ß). Th1-sytokiinit edistävät opsonoivien vasta-aineiden (esim. IgG1) tuotantoa ja solun sytotoksisuuden ja makrofagien aktivoitumisen indusoimista. Th1-vasteet ovat merkittäviä suojautuessa patogeenejä vastaan, jotka replikoituvat solunsisäisesti.
   • Tuumorinekroositekijä (TNF) ja TNF-reseptoriperheen molekyylejä, jotka ovat voimakkaasti tulehdusta edistäviä ja osallistuvat immuunisäätelyyn.
   • Interleukiini-12 (IL-12), joka on keskeinen sytokiini, joka suojaa isäntää virus- ja mikrobiinfektiolta. Se yhdistää immuunijärjestelmän synnynnäiset ja hankitut käsivarret.
   • Interleukiini-18 (IL-18), jonka on osoitettu toimivan kemoattraktanttina.

2. Geenit, jotka osallistuvat profibroottiseen vasteeseen.

   • Transformoiva kasvutekijä beeta (TGFbeta), joka aiheuttaa fibroblastien lisääntymisen.
   • Prokollageeni I ja II.
   • Verihiutaleperäisen kasvutekijän (PDGF) ja PDGF-beeta-reseptorin yli-ilmentyminen on yhdistetty fibroottisen sairauden sekä syövän ja ateroskleroosin kehittymiseen.
   • Matriksin metalloproteinaaseilla on keskeinen rooli angiogeneesissä ja niillä on rooli tuumorigeneesissä.
   • Fibroblastin kasvutekijä.
   • Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), joka tunnetaan angiogeenisistä ominaisuuksistaan.
   • Sidekudoksen kasvutekijä, joka stimuloi kollageenin tuotantoa.

Lisäksi etsitään ja karakterisoidaan uusia geenejä, joita ei ole aiemmin tunnistettu ja joilla on erilainen ilmentyminen.

Tähän projektiin liittyvät viitteet (kirjallisuuden hausta)

1. Chopra, S. Kroonisen hepatiitti C -infektion hoito: Suositukset. Julkaisussa: Up To Date, Rose, BR(Toim.), Up To Date, Wellesley. MA, 2002.
2. Bonis, PLA, Chopra, S. Yhdistetyn interferoni alfa-2b:n ja ribaviriinin anto hepatiitti C -infektion hoidossa. Julkaisussa: Up To Date, Rose, BR(Toim.), Up To Date, Wellesley. MA, 2002.
3. Honda, M, Kaneko, S, Kawai, H, et ai. Erilainen geeniekspressio kroonisten hepatiitti B- ja C-maksavaurioiden välillä. Gastroenterologia 2001; 120: 955-66.
4. Shackel, NA, McGuinness, PH, Abbott, CA, et ai. Näkemyksiä hepatiitti C -virukseen liittyvän kirroosin patobiologiasta: intrahepaattisen differentiaalisen geeniekspression analyysi. Am J Pathol 2002; 160: 641-54.
5. Su, AI, Pezacki, JP, Wodicka L, et ai. Isännän vasteen genominen analyysi hepatiitti C -virusinfektiolle. Proc Natl Acad Sci 2002;99:15669-74.
6. Girard, S, Shalhoub, P, Lescure, P, et ai. Muuttunut soluvaste interferonille ja interleukiini-8:n lisääntynyt säätely, jonka hepatiitti C -viruksen proteiini NS5A indusoi mikrosiruanalyysillä. Virology 2002; 295: 272-83.
7. Ji, X, Cheung, R, Cooper, S, et ai. Interferoni alfa sääteli geeniekspressiota potilailla, jotka aloittavat interferonihoidon krooniseen C-hepatiittiin. Hepatology 2003;37:610-21.
8. Jenkins, RE, Pennington, SR. taulukot proteiinien ilmentymisen profilointiin: kohti kannattavaa vaihtoehtoa kaksiulotteiselle geelielektroforeesille. Proteomics 2001; 1: 12-29.