Farmacogenomica del trattamento con interferone e ribavirina in pazienti con infezione da virus dell'epatite C cronica

Sfondo e piano di ricerca:

L'infezione cronica da HCV segue spesso un decorso progressivo nel corso di molti anni e può portare alla cirrosi e alla necessità di trapianto di fegato o carcinoma epatocellulare. La decisione di trattare i pazienti con infezione da epatite cronica C si basa su diversi fattori, tra cui la storia naturale e lo stadio della malattia, l'efficacia e gli effetti avversi correlati alla terapia. Come regola generale, i pazienti che sono considerati per il trattamento dovrebbero avere evidenza istologica e virologica di infezione cronica (cioè HCV RNA rilevabile nel siero) e un'elevata ALT sierica (1). Il trattamento combinato con interferone e ribavirina è attualmente il miglior trattamento disponibile per l'infezione cronica da HCV. Tuttavia, la risposta alla terapia non è ottimale e ci sono diversi effetti collaterali.

Gli effetti collaterali osservati durante la terapia di pazienti con interferone e ribavirina includono sintomi simil-influenzali principalmente dovuti all'interferone, citopenia ed emolisi indotta da ribavirina. I cambiamenti psichiatrici dovuti all'interferone si verificano fino al 50% e le anomalie della tiroide che richiedono terapia si verificano in circa l'1-5% dei pazienti trattati con interferone. Sono state segnalate anche malattie autoimmuni ed emorragie retiniche. Inoltre, la terapia di associazione è associata a rischi significativi nei pazienti con disfunzione renale, malattie cardiache e anemie emolitiche poiché il trattamento può essere associato all'anemia. Dovrebbero essere esclusi anche i pazienti depressi o con tendenze suicide (2).

Finora è stato fatto poco lavoro sui microarray di DNA con l'HCV. Tuttavia, il lavoro svolto è interessante e promettente. Negli studi che hanno confrontato l'epatite B (HBV) con l'epatite C, è stato riscontrato che l'infezione da HBV esprime geni prevalentemente coinvolti nell'infiammazione. Al contrario, con l'infezione da HCV sono stati trovati geni anti-infiammatori espressi (3). In un altro studio è stato dimostrato che la cirrosi associata all'HCV è caratterizzata da profili di espressione genica proinfiammatoria, profibrotica e proapoptotica (4).

È stata esaminata la progressione dell'infezione da HCV mediante l'analisi dell'espressione genica delle biopsie epatiche in scimpanzé con infezione acuta che sviluppano un'infezione persistente, una clearance virale transitoria o una clearance sostenuta. La clearance virale transitoria e sostenuta è stata associata in modo univoco all'induzione di geni indotti da IFN-gamma e altri geni coinvolti nell'elaborazione e nella presentazione dell'antigene e nella risposta immunitaria adattativa. Lo studio ha rivelato cambiamenti trascrizionali a livello di genoma che riflettono l'instaurarsi, la diffusione e il controllo dell'infezione e rivelano programmi antivirali potenzialmente unici associati alla risoluzione dell'infezione da HCV (5).

Studi in vitro nella linea cellulare umana Huh7 hanno dimostrato che, all'esposizione delle cellule all'interferone, i geni 50 erano sovraregolati di almeno due volte nei cloni di controllo, mentre l'induzione di 9 dei 50 geni era significativamente ridotta in quei cloni Huh7 che esprimevano NS5A. È stato scoperto che l'attività dell'interferone-alfa è inibita dalla proteina NS5A dell'HCV. L'effetto più forte di NS5A sulla risposta dell'interferone è stato osservato sul gene OAS-p69 con espressione ridotta. Inoltre, le cellule Huh7 che esprimono NS5A hanno mostrato una sovraregolazione dell'interleuchina-8, una citochina proinfiammatoria. Di conseguenza questo studio ha postulato un meccanismo per la resistenza all'interferone mediata da NS5A (6).

In un recente studio è stata eseguita la profilazione genica di microarray di cellule mononucleate del sangue periferico da pazienti affetti da epatite C trattati con interferone-alfa. 88 geni direttamente correlati alle funzioni delle cellule immunitarie sono stati up-regolati, compresi i geni coinvolti nell'elaborazione e nella presentazione dell'antigene, nell'attivazione delle cellule T, nel traffico dei linfociti e nelle funzioni effettrici, suggerendo che l'interferone-alfa up-regola più geni che coinvolgono diversi aspetti del sistema immunitario risposte per migliorare l'immunità contro il virus dell'epatite C (7).

Attualmente, il trattamento per l'HCV ha ancora un tasso significativo di non responsivi ed è associato a effetti collaterali che limitano molte persone dal ricevere il trattamento. La profilazione molecolare mediante DNA microarrays ha già identificato potenziali bersagli genetici che potrebbero avere un ruolo nella patogenesi dell'epatite associata all'HCV e, soprattutto, possibili bersagli che hanno un ruolo nella risposta al trattamento con interferone. Il lavoro qui proposto spera di basarsi su questo corpus di conoscenze e può portare a migliori modalità di trattamento per l'HCV.

Metodi/Progettazione sperimentale:

Sarà ottenuta l'approvazione del comitato etico dell'ospedale Alfred e i soggetti saranno reclutati tramite le cliniche per l'epatite dell'ospedale Alfred. Il consenso informato per lo studio sarà ottenuto dopo che il suo scopo è stato spiegato verbalmente e tramite una semplice dichiarazione in inglese. Il consenso informato includerà anche il consenso per le biopsie epatiche. Inizialmente, verrà intrapreso uno studio pilota in cui verrà reclutato un solo soggetto sia per il braccio sperimentale che per quello di controllo dello studio. Una volta che i risultati di questo studio pilota saranno stati analizzati, lo studio sarà ampliato per comprendere un maggior numero di individui.

Le biopsie epatiche saranno eseguite sui seguenti gruppi.

1. Pazienti HCV positivi prima dell'inizio e alla fine del trattamento con interferone standard o pegilato più ribavirina. Questo gruppo sarà suddiviso in responder e non responder al trattamento. Le biopsie epatiche core sotto guida ecografica vengono già eseguite di routine su questo gruppo prima dell'inizio del trattamento. Ai fini di questo studio, i non responsivi alla terapia di combinazione sono quegli individui che rimangono positivi all'HCV-RNA alla fine del trattamento.
2. Popolazione di controllo costituita da pazienti sottoposti a laparotomia per patologie non coinvolgenti il ​​fegato. Queste biopsie sarebbero ottenute al momento dell'intervento chirurgico.

Sarà ottenuto tessuto epatico sufficiente (circa 1-2 mg) per isolare l'RNA messaggero (mRNA) mediante cromatografia con oligo dT. Una volta isolato, l'mRNA sarà retrotrascritto in DNA complementare (cDNA). Questo cDNA verrà quindi etichettato con una molecola reporter fluorescente. L'ibridazione del cDNA epatico marcato avverrà quindi con il DNA microarray. Si prevede che il microarray sarà ottenuto commercialmente e consisterà di cDNA umano. C'è abbastanza DNA sul microarray che due lotti di cDNA epatico marcato con differenti marcatori fluorescenti (es. rosso e verde) possono essere ibridati contemporaneamente all'array senza alcuna interferenza. Verrebbero quindi impostate le seguenti ibridazioni.

Molecola reporter 1: gruppo HCV + ve. cDNA Reporter molecola 2: gruppo HCV -ve. cDNA

Ibridazione 1 Responder a Rx. Prima del cDNA di controllo Rx

Ibridazione 2 Responder a Rx. Dopo Rx Control cDNA

Ibridazione 3 Non rispondente a Rx. Prima del cDNA di controllo Rx

Ibridazione 4 Non rispondente a Rx. Dopo Rx Control cDNA

Rx = trattamento.

L'array ibridato verrà quindi scansionato e verranno utilizzati pacchetti software disponibili in commercio per aiutare nell'interpretazione dei risultati (8). Geni o gruppi di geni di particolare interesse includono:

1. Geni della risposta pro-infiammatoria

   • Citochine Th-1 come Gamma Interferon (IFN), Interleuchina-2 (IL-2) e Tumor Necrosis Factor-beta (TNF-ß). Le citochine Th1 promuovono la produzione di anticorpi opsonizzanti (ad es. IgG1) e l'induzione della citotossicità cellulare e dell'attivazione dei macrofagi. Le risposte Th1 sono importanti nella difesa contro i patogeni che si replicano a livello intracellulare.
   • Fattore di necrosi tumorale (TNF) e famiglia di molecole del recettore del TNF fortemente pro-infiammatorie e coinvolte nella regolazione immunitaria.
   • Interleuchina-12 (IL-12) che è una citochina chiave che protegge l'ospite dall'infezione virale e microbica. Collega le braccia innate e acquisite del sistema immunitario.
   • Interleuchina-18 (IL-18) che ha dimostrato di agire come chemiotattico.

2. Geni coinvolti in una risposta pro-fibrotica.

   • Fattore di crescita trasformante beta (TGFbeta) che causa la proliferazione dei fibroblasti.
   • Procollagene I e II.
   • Il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) e la sovraespressione del recettore beta del PDGF sono stati collegati allo sviluppo di malattie fibrotiche, cancro e aterosclerosi.
   • Le metalloproteinasi della matrice svolgono un ruolo fondamentale nell'angiogenesi e hanno un ruolo nella tumorigenesi.
   • Fattore di crescita dei fibroblasti.
   • Fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) che è noto per le sue proprietà angiogeniche.
   • Fattore di crescita del tessuto connettivo che stimola la produzione di collagene.

Inoltre, verranno ricercati e caratterizzati nuovi geni precedentemente non identificati, con espressione differenziale.

Riferimenti rilevanti per questo progetto (dalla ricerca bibliografica)

1. Chopra, S. Trattamento dell'infezione cronica da epatite C: Raccomandazioni. In: Aggiornato, Rose, BR (a cura di), Aggiornato, Wellesley. MA, 2002.
2. Bonis, PLA, Chopra, S. Somministrazione di interferone combinato alfa-2b e ribavirina nel trattamento dell'infezione da epatite C. In: Aggiornato, Rose, BR (a cura di), Aggiornato, Wellesley. MA, 2002.
3. Honda, M, Kaneko, S, Kawai, H, et al. Espressione genica differenziale tra epatite cronica B e lesioni epatiche C. Gastroenterologia 2001; 120: 955-66.
4. Shackel, NA, McGuinness, PH, Abbott, CA, et al. Approfondimenti sulla patobiologia della cirrosi associata al virus dell'epatite C: analisi dell'espressione genica differenziale intraepatica. Am J Pathol 2002; 160: 641-54.
5. Su, AI, Pezacki, JP, Wodicka L, et al. Analisi genomica della risposta dell'ospite all'infezione da virus dell'epatite C. Proc Natl Acad Sci 2002;99:15669-74.
6. Girard, S, Shalhoub, P, Lescure, P, et al. Una risposta cellulare alterata all'interferone e up-regulation dell'interleuchina-8 indotta dalla proteina virale dell'epatite C NS5A scoperta dall'analisi dei microarray. Virologia 2002; 295: 272-83.
7. Ji, X, Cheung, R, Cooper, S, et al. L'interferone alfa ha regolato l'espressione genica nei pazienti che iniziano il trattamento con interferone per l'epatite cronica C. Hepatology 2003;37:610-21.
8. Jenkins, RE, Pennington, SR. array per la profilazione dell'espressione proteica: verso una valida alternativa all'elettroforesi su gel bidimensionale. Proteomica 2001; 1: 12-29.