非顕在性 DIC におけるトロンビン生成とトロンボエラストグラフィ

凝固系の活性化は、敗血症患者の早期に発生しますが、臨床的に明白な播種性血管内凝固 (DIC) は、重症敗血症患者の少数でのみ確認されます。 凝固系の制御されていない活性化は、多臓器不全の病態生理学、およびその後の敗血症の罹患率と死亡率に寄与する可能性があります。 重度の敗血症および DIC への進行を予測する危険因子の特定は、とらえどころのないものでした。 全血および細胞が豊富な凝固アッセイは、敗血症の初期に発生する凝固促進および抗凝固の両方の変化に対する感度を改善し、非明白なDICの認識を改善することを提案します。 今後の研究では、これらのアッセイが早期介入の恩恵を受ける可能性のある患者のサブグループを特定するのに十分に高い予測値を持っているかどうかに対処します.

具体的な目的:

1. トロンビン生成の増加は、明白な DIC の発症に臨床的に有意な期間先行すると仮定します。 私たちの主な目的は、DICおよび臓器不全の発症前の敗血症の最初の診断で測定された内因性トロンビンの可能性が明白なDICの予測であるかどうかを判断することです。
2. 凝固タンパク質内の既知および未知の多型による内因性トロンビン生成には、健康な集団の間で大きな個人差があります。 トロンビン生成における宿主変数は、DIC に対する感受性と敗血症中の転帰不良に寄与すると予測しています。 この研究の第 2 の目的は、ホスト凝固変数が敗血症に関連する罹患率と死亡率の素因となるかどうかを判断することです。

実験計画と方法

研究デザインは、敗血症で記念ヘルマン病院救急部に来院した患者の前向き観察研究です。 敗血症の基準には、ACCP/SCCM コンセンサス会議によって定義された全身性炎症反応症候群の証拠、および既知または疑わしい感染症が含まれます。 除外基準には、重度の敗血症または敗血症性ショックの徴候が含まれます。これは、ACCP/SCCM コンセンサス会議で定義されているように、プレゼンテーションで次のものを含みます。臓器機能障害、低灌流、および灌流異常。 好中球減少症や鎌状赤血球症などの免疫抑制または凝固障害に関連する慢性的な病状、および慢性ステロイド使用または抗凝固療法などの免疫機能障害または凝固障害を引き起こす薬物の使用も、除外の理由となります。 さらに、実験室での研究のために各患者から必要な血液量のため、体重が25kg以上の患者のみが登録されます。 研究からの撤退は、担当医師または被験者の裁量による。 中止した患者から臨床情報を収集するためにあらゆる努力が払われます。

包含基準

• -治療する医師によって決定された既知または疑いのある感染-入院する患者
• 全身性炎症反応症候群: 次の 4 つの基準のうちの 3 つ:
• 温度 > 38 C または < 35 C
• 心拍数が 90 回/分を超える場合。ただし、心拍数が上昇することが知られている病状のある患者、または頻脈を予防する治療を受けている患者は除きます。
• 呼吸数 > 20 回/分または PaC02 < 32 mmHg、または急性呼吸プロセスのための人工呼吸。
• 白血球数 > 12,000/mm3、< 4,000/mm3、または > 10% バンド

除外基準

• -次の薬の使用: 注入前 8 時間以内の活動性血栓イベントを治療するための未分画ヘパリン。 -注入前12時間以内に推奨される予防的使用よりも高用量の低分子量ヘパリン、研究開始から7日以内に使用されたワルファリン、研究前3日以内に650 mg /日を超える用量でのアスピリンの使用、 -試験前3日以内の血栓溶解療法、試験登録前7日以内の糖タンパク質IIb / IIIa拮抗薬、試験登録前24時間の活性化プロテインC（Xigris ）の投与。
• 好中球減少症
• 血友病
• 糖尿病性ケトアシドーシス
• 体重 < 25 kg

患者は、会議の適格性から 2 時間以内に救急部門に登録されます。 書面によるインフォームドコンセントは、患者またはその正式な代理人から取得されます。 血液サンプルは、登録後最初の 1 時間は末梢静脈穿刺によって採取され、その後 7 日間 1 日 1 回採取されます (付録 A を参照)。

インフォームドコンセントを得てから2時間以内に採血が行われない場合、患者は研究から除外されます。

臨床データ収集 臨床データフォーム (付録 B を参照) は、登録時および 7 日間毎日、退院時、および 28 日間記入されます。 臨床医は、研究所の検査結果を知ることができません。

実験方法

血液および血漿 各患者は、登録時に 15 ml の血液を採取します。 標本は、前肘静脈穿刺によって得られます。 フリーフローまたは最小限の吸引が採用されます。真空容器は避けます。 貧血小板血漿（ＰＰＰ）および全血分析用の検体は、抗凝固剤１部対全血９部の比率で０．１０５Ｍのクエン酸三ナトリウムを含むシリコンガラス管に収集される。 PPP は 60 分以内に分離され、すぐに分析されます。 多血小板血漿 (PRP) 標本は、室温で 265g で 10 分間遠心分離した後、上部 3/4 量の血漿上清から分離されます。 血小板はBeckman Coulterカウンターで計数し、自家PPPで150×10 9 血小板/lに調整する。 PRPは60分以内に使用されます。 Cbc、PT/PTT、フィブリノーゲン、d-ダイマー、プロテイン C 活性、プロテイン S 活性、ATIII 活性、第 V 因子ライデン変異、プロトロンビン G20210A 変異分析は、メモリアル ハーマン病院の臨床検査室で実施されます。

RoTEG

上述のように全血標本を採取する。 Pentapharm の 2 台の roTEG Coagulation Analyzer で測定を行います。 RoTEG オール プラスチック リアクション カップはメーカーから調達されます。 ポリプロピレンとポリエチレンのピペットは、試薬と血液の取り扱いに使用されます。 クエン酸添加全血は、20 mcl 0.2 mol/L CaCl2 によって再石灰化され、ナトリウム バルビタール バッファーを使用して 1:1000 に希釈された組換えヒト TF (Innovin) の 20 mcl 溶液によって活性化されます。 測定パラメーターは、メーカーによって次のように定義されています。凝固時間 (CT) は、凝固の Ca2+ 活性化から、縦軸で 2 mm に相当する弾性の増加が得られるまでの秒単位の時間です。 血餅形成時間 (CFT) は、弾性が縦軸で 2 mm から 20 mm に増加する間に経過する時間 (秒) です。 最大血餅形成 (MCF) は、最終的な血餅の最大強度をミリメートル単位で表します。 血餅形成の連続的な登録を表すいくつかの追加パラメータが Sorensen らによって定義されています 28: 血餅形成の最大速度 (MaxVel)、血餅形成の最大速度 (T,MaxVel) までの時間、および速度曲線の下の面積(AUC)。

トロンビンの生成

Hemker の方法論を使用して、キャリブレーションされた自動トロンビン生成測定が実行されます。 29 多血小板血漿 (PRP) は、上記のように調製されます。 蛍光基質と発色性トロンビンはThermolabsystemsから購入し、組換え再脂質化組織因子（TF）はDade Behringから購入します。 キャリブレーターとして使用されるアルファ 2 マクログロブリン - トロンビン複合体は、Thrombolabsystems から購入します。 トロンボグラムは、96 ウェル プレート蛍光光度計 (Ascent リーダー、Thrombolabsystems) で測定され、Thrombinoscope から購入したソフトウェアで分析されます。 実験は 4 連で実施され、キャリブレーターと比較されます。 各ウェルに 80 mcl の血漿を加え、続いてキャリブレーターまたはバッファー、次に「トリガー」: 20 mcl の 3 mM TF を加えます。 プレートを蛍光光度計に入れ、37℃まで温めます。 計測器は、測定するすべてのウェルに 20 mcl の蛍光基質 2.5 mM および CaCl2 100 mM (FluCa) を分注し、これをゼロ時間として登録し、10 秒間振って読み取りを開始します。 測定中、プログラムは TG と CL からの読み取り値を比較し、トロンビン濃度を計算し、トロンビン濃度を時間で表示します。 トロンビンのピークは、トロンビンの形成と阻害の時間経過中に到達する最高のトロンビン濃度です。 トロンビン ポテンシャルは、60 分以内に形成されるトロンビンの量です (曲線下の面積)。 ラグ フェーズとピーク時間は、それぞれトロンビン形成の開始と速度を表します。

データ管理 データは、GCRC インフォマティクス コア セクションによって作成される紙のフォームに収集されます。 GCRC インフォマティクス コアは、安全なデータベース (アクセス) でデータを維持します。 各被験者には、登録が行われた順序を反映する一意の ID が割り当てられます。

データ分析とプレゼンテーション

これは、将来の臨床研究のための予備データを提供することを目的としたパイロット研究です。 記述統計は、敗血症の最初のプレゼンテーションで ETP と roTEG を特徴付けるために使用されます。 平均値と範囲は、トロンビン生成アッセイ (遅延時間、上昇の勾配、ピーク値、および曲線下面積) および roTEG (血餅形成時間 (CFT)、最大血餅形成 (MCF)) の各変数について報告されます。血餅形成の最大速度 (MaxVel)、血餅形成の最大速度 (T,MaxVel) までの時間、速度曲線下面積 (AUC))。 この研究の主な目的は、陽性のISTH DICスコアによって定義されるように、プレゼンテーション時のETPをDICの発症と比較することです。 二次的な目的は、ETP、roTEG、Pro C、Pro S、ATIII、FVL、およびプレゼンテーション時のプロトロンビン G20210A 変異を含む宿主凝固変数を、28 日死亡率および臓器機能障害の二次結果測定値と比較することです。 すべての統計は、NCSS/PASS を使用して実行されます。

サンプル サイズの決定: 敗血症または DIC におけるトロンビン生成アッセイまたはトロンボエラストグラフィーに関する公開されたレポートはありません。 抗凝固剤 (ワルファリン) を服用している患者に関する以前の研究では、ETP が 400% 減少しました (1719 から 404)。 目標幅が 100 で 95% 信頼区間の平均 ETP を導き出すには、標準偏差を 259 と仮定すると、100 人の患者を登録する必要があります。

データの分析には、次の統計手法を使用します。

特定の目的 #1: 内因性トロンビン ポテンシャル (ETP) は、トロンビン生成アッセイの曲線下の領域です。 値は連続しており、範囲は 0 ～ 2,500 です。 roTEG からの最大血餅形成 (MCF) も ETP を概算するために使用されます。 DIC スコアは、二分変数として計算され、コード化されます: はい (スコア > 5) または いいえ (スコア < 5)。 ETP と MCT の受信者動作曲線と、DIC を予測するための感度と特異性が導き出されます。 曲線の下の領域が有意であることが判明した場合、最高の精度を持つ最適なカットオフ値が選択されます。 この値は、テストの予測値を推定するために使用されます。 陽性適中率は次の式で計算されます: ETP または MCT がカットオフを超えて DIC を発症した患者数 / DIC スコアが陽性の患者数。 負の DIC スコアの予測値は、次の式を使用して計算されます: ETP または MCT がカットオフを下回り、DIC への進行がない患者数 / DIC スコアが負の患者数。

特定の目的 #2: 予測変数 (ETP、MCT、Pro C、Pro S、ATIII、FVL、ProG20210A、DIC) のどれが二次的な二分結果測定に関連しているかを判断するために、多変量解析が行われます: 28 歳での臓器不全日 (Any/None)、28 日間の死亡率 (Dead/Alive)。