비현성 DIC에서 트롬빈 생성 및 트롬보엘라스토그래피

응고 시스템의 활성화는 패혈증 환자에서 초기에 발생하지만, 임상적으로 명백한 파종성 혈관내 응고(DIC)는 중증 패혈증 환자의 소수에서만 확인됩니다. 응고 시스템의 제어되지 않은 활성화는 다발성 장기 부전의 병태생리학 및 후속 이환율 및 패혈증의 사망률에 기여할 수 있습니다. 중증 패혈증 및 DIC로의 진행을 예측하는 위험 인자의 식별은 파악하기 어렵습니다. 우리는 전혈 및 세포가 풍부한 응고 분석이 패혈증 초기에 발생하는 응고 촉진제 및 항응고제 변화 모두에 대해 개선된 민감도를 제공하고 비명백한 DIC의 인식을 개선할 것이라고 제안합니다. 향후 연구에서는 이러한 분석법이 조기 개입으로 혜택을 받을 수 있는 환자의 하위 그룹을 식별하기에 충분히 높은 예측 가치를 가지고 있는지 여부를 다룰 것입니다.

구체적인 목표:

1. 우리는 증가된 트롬빈 생성이 임상적으로 유의미한 기간에 의해 명백한 DIC의 발달보다 선행할 것이라는 가설을 세웁니다. 우리의 주요 목표는 DIC 및 장기 부전이 시작되기 전에 패혈증의 첫 진단에서 측정된 내인성 트롬빈 전위가 명백한 DIC를 예측하는지 확인하는 것입니다.
2. 응고 단백질 내의 알려진 다형성과 알려지지 않은 다형성으로 인해 내인성 트롬빈 생성에서 건강한 인구 사이에 상당한 개인차가 있습니다. 우리는 트롬빈 생성의 숙주 변수가 DIC에 대한 감수성과 패혈증 동안 불량한 결과에 기여할 것이라고 예측합니다. 이 연구의 두 번째 목적은 숙주 응고 변수가 패혈증과 관련된 이환율 및 사망률에 소인이 있는지 확인하는 것입니다.

실험 설계 및 방법

연구 설계는 패혈증으로 Memorial Hermann 병원 응급실에 내원한 환자에 대한 전향적 관찰 연구가 될 것입니다. 패혈증의 기준에는 ACCP/SCCM 합의 회의에서 정의한 전신 염증 반응 증후군의 증거와 알려지거나 의심되는 감염이 포함됩니다. 제외 기준에는 발표 시 ACCP/SCCM 합의 회의에서 정의한 바와 같이 중증 패혈증 또는 패혈성 쇼크의 징후가 포함되며 장기 기능 장애, 저관류 및 관류 이상을 포함합니다. 호중구 감소증 및 겸상적혈구병과 같은 면역 억제 또는 응고병증과 관련된 만성 의학적 상태, 만성 스테로이드 사용 또는 항응고제와 같은 면역 기능 장애 또는 응고병증으로 이어지는 약물 사용도 배제 사유가 됩니다. 또한 실험실 연구를 위해 각 환자에게 필요한 혈액의 양이 많기 때문에 체중이 25kg 이상인 환자만 등록됩니다. 연구로부터의 철회는 치료하는 의사 또는 피험자의 재량에 따를 것입니다. 탈퇴한 환자들로부터 임상 정보를 수집하기 위해 모든 노력을 기울일 것입니다.

포함 기준

• 치료 의사가 결정한 알려진 또는 의심되는 감염 병원에 입원할 환자
• 전신 염증 반응 증후군: 다음 4가지 기준 중 3가지:
• 온도 > 38C 또는 < 35C
• 심박수 > 90회/분, 심박수를 증가시키는 것으로 알려진 의학적 상태가 있는 환자 또는 빈맥을 예방하는 치료를 받는 환자는 예외입니다.
• 호흡수 > 20 호흡/분 또는 PaC02 < 32 mmHg, 또는 급성 호흡 과정을 위한 기계 환기 사용.
• 백혈구 수 > 12,000/mm3, < 4,000/mm3 또는 > 10% 밴드

제외 기준

• - 다음 약물의 사용: 주입 전 8시간 이내에 활성 혈전성 사건을 치료하기 위한 미분획 헤파린; 주입 전 12시간 이내에 예방적 사용을 위해 권장되는 것보다 고용량의 저분자량 헤파린, 연구 시작 7일 이내에 사용된 와파린, 연구 전 3일 이내에 650mg/일 이상의 용량으로 아스피린 사용, 연구 전 3일 이내에 혈전용해 요법, 연구 시작 전 7일 이내에 당단백질 IIb/IIIa 길항제, 연구 시작 전 24시간 동안 활성화된 단백질 C(Xigris) 투여.
• 호중구감소증
• 혈우병
• 당뇨병성 케톤산증
• 무게 < 25kg

환자는 자격 충족 후 2시간 이내에 응급실에 등록됩니다. 환자 또는 권한을 부여받은 대리인으로부터 서면 동의를 얻습니다. 혈액 샘플은 등록 후 처음 1시간 동안 말초 정맥 천자에 의해 수집되고 이후 7일 동안 매일 1회 수집됩니다(부록 A 참조).

정보에 입각한 동의를 얻은 후 2시간 이내에 혈액 샘플링을 수행하지 않으면 환자는 연구에서 제외됩니다.

임상 데이터 수집 임상 데이터 양식(부록 B 참조)은 등록 시 및 7일 동안 매일, 퇴원 시 및 28일에 작성됩니다. 임상의는 연구실 테스트 결과에 대해 눈이 멀게 됩니다.

실험실 방법

혈액 및 혈장 각 환자는 등록 시 15ml의 혈액을 채취합니다. 검체는 전주 정맥 천자를 통해 채취합니다. 자유 흐름 또는 최소한의 흡입이 사용됩니다. 진공 용기는 피할 것입니다. 혈소판 결핍 혈장(PPP) 및 전혈 분석을 위한 검체는 항응고제 1부와 전혈 9부의 비율로 0.105M 구연산삼나트륨이 포함된 실리콘 유리관에 수집됩니다. PPP는 60분 이내에 분리되어 즉시 분석됩니다. 혈소판이 풍부한 혈장(PRP) 표본은 실온에서 10분 동안 265g에서 원심분리한 후 혈장 상층액의 상위 3/4 부피에서 분리됩니다. 혈소판은 Beckman Coulter 카운터에서 계산되고 자가 PPP를 사용하여 150 X 109 혈소판/l로 조정됩니다. PRP는 60분 이내에 사용됩니다. Cbc, PT/PTT, 피브리노겐, d-다이머, 단백질 C 활성, 단백질 S 활성, ATIII 활성, 인자 V 라이덴 돌연변이, 프로트롬빈 G20210A 돌연변이 분석은 Memorial Herman 병원 임상 실험실에서 수행됩니다.

RoTEG

전혈 표본은 위에서 설명한 대로 채취됩니다. 측정은 Pentapharm의 두 가지 roTEG 응고 분석기에서 수행됩니다. RoTEG 완전 플라스틱 반응 컵은 제조업체에서 조달합니다. 폴리프로필렌 및 ​​폴리에틸렌 피펫은 시약 및 혈액을 처리하는 데 사용됩니다. 구연산 전혈은 20 mcl 0.2 mol/L CaCl2에 의해 재석회화되고 나트륨 바르비탈 완충액을 사용하여 1:1000으로 희석된 재조합 인간 TF(Innovin)의 20 mcl 용액에 의해 활성화됩니다. 측정된 매개변수는 제조업체에서 다음과 같이 정의했습니다. 응고 시간(CT)은 Ca2+ 응고 활성화부터 세로축에서 2 그래픽 mm에 해당하는 탄력 증가가 얻어질 때까지의 시간(초)입니다. 혈전 형성 시간(CFT)은 종축에서 탄성이 2mm에서 20mm로 증가하는 동안 경과하는 시간(초)입니다. 최대 응고 형성(MCF)은 최종 응고의 최대 강도(밀리미터)를 나타냅니다. 혈전 형성의 연속 등록을 나타내는 몇 가지 추가 매개변수는 Sorensen et al 28에 의해 정의되었습니다. (AUC).

트롬빈 생성

보정된 자동 트롬빈 생성 측정은 Hemker 방법론을 사용하여 수행됩니다. 29 혈소판 풍부 혈장(PRP)은 위에서 설명한 대로 준비됩니다. Fluorogenic 기질과 chromogenic thrombin은 Thermolabsystems를 통해, recombinant relipidated tissue factor(TF)는 Dade Behring을 통해 구매할 예정입니다. 캘리브레이터로 사용되는 알파 2 마크로글로불린-트롬빈 복합체는 Thrombolabsystems를 통해 구입합니다. 혈전도는 96웰 플레이트 형광계(Ascent reader, Thrombolabsystems)에서 측정되고 Thrombinoscope를 통해 구입한 소프트웨어로 분석됩니다. 실험은 4중으로 수행되고 교정기와 비교됩니다. 각 웰에 80mcl의 혈장이 추가되고, 교정기 또는 완충액이 추가된 다음 "트리거": 3mM TF 20mcl이 추가됩니다. 플레이트를 형광계에 놓고 37℃로 데울 수 있습니다. 기기는 측정할 모든 웰에 Fluorogenic 기질 2.5mM 및 CaCl2 100mM(FluCa) 20mcl을 분배하고 이를 0 시간으로 등록하고 10초 동안 흔들고 판독을 시작합니다. 측정하는 동안 프로그램은 TG와 CL의 판독값을 비교하고 트롬빈 농도를 계산하고 시간에 따라 트롬빈 농도를 표시합니다. 피크 트롬빈은 트롬빈 형성 및 억제의 시간 경과 동안 도달한 최고 트롬빈 농도입니다. 트롬빈 전위는 60분 이내에 형성되는 트롬빈의 양입니다(곡선 아래 면적). 지연기 및 피크 시간은 각각 트롬빈 형성의 시작 및 속도를 나타냅니다.

데이터 관리 데이터는 GCRC 정보학 핵심 섹션에서 설계할 종이 양식으로 수집됩니다. GCRC 정보학 코어는 보안 데이터베이스(Access)에서 데이터를 유지 관리합니다. 각 과목에는 등록이 이루어진 순서를 반영하는 고유 ID가 할당됩니다.

데이터 분석 및 프레젠테이션

이는 향후 임상 연구를 위한 예비 데이터를 제공하기 위한 파일럿 연구입니다. 기술 통계는 패혈증의 초기 프레젠테이션에서 ETP 및 roTEG를 특성화하는 데 사용됩니다. 트롬빈 생성 분석(지체 시간, 상승 기울기, 피크 값 및 곡선 아래 면적) 및 roTEG(응고 형성 시간(CFT), 최대 응고 형성(MCF), 혈전 형성의 최대 속도(MaxVel), 혈전 형성의 최대 속도까지의 시간(T,MaxVel), 속도 곡선 아래 면적(AUC)). 이 연구의 주요 목적은 긍정적인 ISTH DIC 점수로 정의되는 DIC의 발달과 제시 시 ETP를 비교하는 것입니다. 2차 목적은 제시 시 ETP, roTEG, Pro C, Pro S, ATIII, FVL 및 프로트롬빈 G20210A 돌연변이를 포함한 숙주 응고 변수를 28일 사망률 및 장기 기능 장애의 2차 결과 측정과 비교하는 것입니다. 모든 통계는 NCSS/PASS를 사용하여 수행됩니다.

샘플 크기 결정: 패혈증 또는 DIC에서 트롬빈 생성 분석 또는 혈전탄성조영술에 대한 발표된 보고서는 없습니다. 항응고제(와파린)를 복용하는 환자에 대한 이전 연구에서 ETP가 400% 감소했습니다(1719-404). 목표 너비가 100이고 신뢰 구간이 95%인 평균 ETP를 도출하려면 표준 편차를 259로 가정하고 100명의 환자를 등록해야 합니다.

데이터 분석을 위해 다음 통계 방법을 사용합니다.

특정 목표 #1: 내인성 트롬빈 전위(ETP)는 트롬빈 생성 분석의 곡선 아래 영역입니다. 값은 연속적이며 범위는 0~2,500입니다. roTEG의 최대 응고 형성(MCF)도 ETP를 근사화하는 데 사용됩니다. DIC 점수는 예(점수 > 5) 또는 아니요(점수 < 5)의 이분법 변수로 계산 및 코딩됩니다. ETP 및 MCT에 대한 수신자 작동 곡선과 DIC 예측을 위한 민감도 및 특이성이 도출됩니다. 곡선 아래 영역이 중요한 것으로 확인되면 정확도가 가장 높은 최적의 컷오프 값이 선택됩니다. 이 값은 테스트의 예측 값을 추정하는 데 사용됩니다. 양성 예측값은 다음 공식으로 계산됩니다: DIC의 컷오프 및 발달 이상의 ETP 또는 MCT 환자 # / 양성 DIC 점수 환자 #. 음수 DIC 점수의 예측 값은 다음 공식을 사용하여 계산됩니다. ETP 또는 MCT가 컷오프 미만이고 DIC로 진행되지 않는 환자 # / DIC 음수 환자 #.

특정 목표 #2: 예측 변수(ETP, MCT, Pro C, Pro S, ATIII, FVL, ProG20210A, DIC) 중 어느 것이 이차 이분법 결과 측정과 연관되는지 결정하기 위해 다변량 분석이 수행됩니다. 28세에 장기 기능 장애 일(없음/없음), 28일 사망률(죽음/살아 있음).