Trombingenerering och tromboelastografi i icke-öppen DIC

Aktivering av koagulationssystemet sker tidigt hos patienter med sepsis, även om kliniskt öppen disseminerad intravaskulär koagulation (DIC) identifieras hos endast en minoritet av patienter med svår sepsis. Okontrollerad aktivering av koagulationssystemet kan bidra till patofysiologin för multipel organsvikt och den efterföljande morbiditeten och dödligheten av sepsis. Identifiering av riskfaktorer som förutsäger progression till svår sepsis och DIC har varit svårfångade. Vi föreslår att helblods- och cellrika koagulationsanalyser kommer att erbjuda förbättrad känslighet för både prokoagulerande och antikoagulerande förändringar som inträffar tidigt i sepsis och kommer att förbättra igenkänningen av icke-öppen DIC. Framtida studier kommer att ta upp huruvida dessa analyser har tillräckligt högt prediktivt värde för att identifiera undergrupper av patienter som skulle kunna dra nytta av tidig intervention.

Specifika mål:

1. Vi antar att ökad trombingenerering kommer att föregå utveckling av öppen DIC med en kliniskt signifikant tidsperiod. Vårt primära mål är att fastställa om endogen trombinpotential uppmätt vid första diagnosen av sepsis före uppkomsten av DIC och organsvikt är förutsägande för öppen DIC.
2. Det finns betydande individuell variation bland den friska befolkningen i endogen trombingenerering på grund av kända och okända polymorfismer inom koagulationsproteiner. Vi förutspår att värdvariabler i trombingenerering kommer att bidra till känslighet för DIC och dåligt resultat under sepsis. Ett sekundärt syfte med denna studie är att fastställa om värdens koagulationsvariabler predisponerar för sjuklighet och dödlighet i samband med sepsis.

Experimentell design och metoder

Studiedesignen kommer att vara en prospektiv observationsstudie av patienter som kommer till Memorial Hermann Hospitals akutmottagning med sepsis. Kriterier för sepsis inkluderar tecken på systemiskt inflammatoriskt svarssyndrom enligt definitionen av ACCP/SCCM Consensus Conference, och en känd eller misstänkt infektion. Uteslutningskriterier inkluderar tecken på allvarlig sepsis eller septisk chock, enligt definitionen av ACCP/SCCM Consensus Conference, vid presentationen, inklusive: organdysfunktion, hypoperfusion och perfusionsavvikelser. Kroniska medicinska tillstånd associerade med immunsuppression eller koagulopatier, såsom neutropeni och sicklecellssjukdom, och användning av mediciner som leder till immundysfunktion eller koagulopatier, såsom kronisk steroidanvändning eller antikoagulation, kommer också att vara skäl för uteslutning. På grund av den blodvolym som krävs från varje patient för laboratoriestudier kommer dessutom endast patienter med en kroppsvikt på 25 kg eller mer att registreras. Utträde från studien kommer att ske efter bedömning av den behandlande läkaren eller försökspersonen. Alla ansträngningar kommer att göras för att samla in klinisk information från patienter som har dragit sig tillbaka.

Inklusionskriterier

• Känd eller misstänkt infektion som fastställts av den behandlande läkaren Patient som ska läggas in på sjukhuset
• Systemic Inflammatory Response Syndrome: 3 av följande 4 kriterier:
• Temperatur > 38 C eller < 35 C
• Hjärtfrekvens > 90 slag/min, förutom hos patienter med ett medicinskt tillstånd som är känt för att öka hjärtfrekvensen eller de som får behandling som skulle förhindra takykardi.
• Andningsfrekvens > 20 andetag/min eller PaC02 < 32 mmHg, eller vid mekanisk ventilation för en akut andningsprocess.
• Antal vita blodkroppar > 12 000/mm3, < 4 000/mm3 eller > 10 % band

Exklusions kriterier

• - Användning av följande mediciner: ofraktionerat heparin för att behandla en aktiv trombotisk händelse inom 8 timmar före infusionen; lågmolekylärt heparin i en högre dos än vad som rekommenderas för profylaktisk användning inom 12 timmar före infusionen, warfarin används inom 7 dagar efter studiestart, aspirinanvändning i en dos på mer än 650 mg/dag inom 3 dagar före studien, trombolytisk behandling inom 3 dagar före studien, glykoprotein IIb/IIIa-antagonister inom 7 dagar före studiestart, administrering av aktiverat protein C (Xigris ) under 24 timmar före studiestart.
• Neutropeni
• Hemofili
• Diabetisk ketoacidos
• Vikt < 25 kg

Patienter kommer att skrivas in på akutmottagningen inom 2 timmar efter att de träffats. Skriftligt informerat samtycke kommer att erhållas från patienterna eller deras auktoriserade representanter. Blodprover kommer att tas genom perifer venpunktion under den första timmen efter inskrivningen och sedan en gång dagligen i 7 dagar (se bilaga A).

Patienter kommer att dras ur studien om blodprov inte utförs inom 2 timmar efter att ha erhållit informerat samtycke.

Klinisk datainsamling Kliniska dataformulär (se bilaga B) kommer att fyllas i vid tidpunkten för inskrivningen och dagligen i 7 dagar, vid utskrivning från sjukhuset och vid 28 dagar. Läkare kommer att bli blinda för resultaten av forskningslaboratorietester.

Laboratoriemetoder

Blod och plasma Varje patient kommer att få 15 ml blod samlat in vid inskrivningen. Prover kommer att tas genom antecubital venpunktion. Fritt flöde eller minimalt sug kommer att användas; vakuumbehållare kommer att undvikas. Prover för blodplättsfattig plasma (PPP) och helblodsanalys kommer att samlas in i silikoniserade glasrör med 0,105 M trinatriumcitrat i förhållandet 1 del antikoagulant till 9 delar helblod. PPP kommer att separeras inom 60 minuter och analyseras omedelbart. Trombocytrika plasmaprover (PRP) kommer att separeras från den övre ¾ volymen av plasmasupernatanten efter centrifugering vid 265 g i 10 minuter vid rumstemperatur. Trombocyterna kommer att räknas på en Beckman Coulter-räknare och justeras till 150 X 109 blodplättar/l med autolog PPP. PRP kommer att användas inom 60 minuter. Cbc, PT/PTT, Fibrinogen, d-dimer, Protein C-aktivitet, Protein S-aktivitet, ATIII-aktivitet, Faktor V Leiden-mutation, Protrombin G20210A-mutationsanalys kommer att utföras i Memorial Herman Hospitals kliniska laboratorier.

RoTEG

Helblodsprover kommer att tas enligt beskrivningen ovan. Mätningar kommer att utföras på två roTEG koagulationsanalysatorer från Pentapharm. RoTEG reaktionskoppar i helplast anskaffas från tillverkaren. Pipetter av polypropen och polyeten används för att hantera reagenser och blod. Citrerat helblod kommer att återförkalkas med 20 mcl 0,2 mol/L CaCl2 och aktiveras med 20 mcl lösning av rekombinant human TF (Innovin) utspädd 1:1000 med en natriumbarbitalbuffert. De uppmätta parametrarna har definierats av tillverkaren enligt följande: Koagulationstiden (CT) är tiden i sekunder från Ca2+ aktivering av koagulation och tills en ökning av elasticiteten motsvarande 2 grafiska mm erhålls på ordinatan. Koagelbildningstiden (CFT) är tiden i sekunder som går medan elasticiteten ökar från 2 mm till 20 mm på ordinatan. Den maximala koagelbildningen (MCF) uttrycker den maximala styrkan i millimeter av den slutliga koageln. Flera ytterligare parametrar som representerar den kontinuerliga registreringen av koagelbildning har definierats av Sorensen et al 28: maximal hastighet (MaxVel) för koagelbildning, tiden till maximal hastighet (T,MaxVel) för koagelbildning och arean under hastighetskurvan (AUC).

Trombingenerering

Kalibrerade automatiserade trombingenereringsmätningar kommer att utföras med hjälp av Hemker-metoden. 29 Trombocytrik plasma (PRP) kommer att beredas enligt beskrivningen ovan. Fluorogent substrat och kromogent trombin kommer att köpas genom Thermolabsystems, och rekombinant relipidated tissue factor (TF) genom Dade Behring. alfa 2-makroglobulin-trombinkomplex som används som kalibrator kommer att köpas via Thrombolabsystems. Trombogrammen kommer att mätas i en 96-brunnars plattfluorometer (Ascent reader, Thrombolabsystems) och analyseras med programvara köpt via Thrombinoscope. Experiment kommer att utföras i fyrdubbla exemplar och jämföras med en kalibrator. Till varje brunn kommer 80 mcl plasma att läggas, följt av kalibratorn eller bufferten, sedan "triggern": 20 mcl av 3 mM TF. Plattan placeras i fluorometern och får värmas till 37 C. Instrumentet dispenserar 20 mcl fluorogent substrat 2,5 mM och CaCl2 100 mM (FluCa) till alla brunnar som ska mätas, registrerar detta som nolltid, skakar dem i 10 s och börjar läsa. Under mätningen jämför programmet avläsningarna från TG och CL, beräknar trombinkoncentrationen och visar trombinkoncentrationen i tid. Topptrombinet är den högsta trombinkoncentrationen som uppnås under tidsförloppet för trombinbildning och hämning. Trombinpotentialen är mängden trombin som bildas inom 60 minuter (Area under kurvan). Fördröjningsfasen och topptiden hänvisar till start respektive hastighet av trombinbildning.

Datahantering Data kommer att samlas in på pappersformulär som kommer att utformas av GCRC-informatiks kärnsektion. GCRC-informatikkärnan kommer att upprätthålla data i en säker databas (Access). Varje ämne kommer att tilldelas ett unikt ID som återspeglar i vilken ordning registreringen skedde.

Dataanalys och presentation

Detta är en pilotstudie avsedd att tillhandahålla preliminära data för framtida kliniska studier. Beskrivande statistik kommer att användas för att karakterisera ETP och roTEG vid initial presentation av sepsis. Medelvärden och intervall kommer att rapporteras för var och en av variablerna i trombingenereringsanalysen (fördröjningstid, stigningslutning, toppvärde och area under kurvan) och roTEG (koagelbildningstid (CFT), maximal koagelbildning (MCF), maximal hastighet (MaxVel) för koagelbildning, tid till maximal hastighet (T,MaxVel) för koagelbildning och area under hastighetskurvan (AUC)). Det primära syftet med denna studie är att jämföra ETP vid presentationen med utvecklingen av DIC, som definieras av en positiv ISTH DIC-poäng. Det sekundära målet kommer att vara att jämföra värdkoagulationsvariabler, inklusive ETP, roTEG, Pro C, Pro S, ATIII, FVL och protrombin G20210A-mutation vid presentationen, med de sekundära utfallsmåtten på 28-dagars mortalitet och organdysfunktion. All statistik kommer att utföras med NCSS/PASS.

Bestämning av provstorlek: Det finns inga publicerade rapporter om trombingenereringsanalyser eller tromboelastografi vid sepsis eller DIC. I våra tidigare studier av patienter som tog ett antikoagulantia (warfarin) fanns en 400 % minskning av ETP (1719 till 404). För att härleda en genomsnittlig ETP med en målbredd på 100 och 95 % konfidensintervall, under antagande av en standardavvikelse på 259, kommer vi att behöva registrera 100 patienter.

Vi kommer att använda följande statistiska metoder för analys av data:

Specifikt mål #1: Den endogena trombinpotentialen (ETP) är området under kurvan för trombingenereringsanalysen. Värdena är kontinuerliga och sträcker sig från 0 till 2 500. Maximal koagelbildning (MCF) från roTEG kommer också att användas för att uppskatta ETP. DIC-poängen kommer att beräknas och kodas som en dikotom variabel: Ja (poäng > 5) eller Nej (poäng < 5). En mottagares driftkurva kommer att härledas för ETP och MCT och dess känslighet och specificitet för att förutsäga DIC. Om arean under kurvan visar sig vara signifikant kommer ett optimalt gränsvärde med högsta noggrannhet att väljas. Detta värde kommer att användas för att uppskatta testets prediktiva värde. Positivt prediktivt värde kommer att beräknas med formeln: # patienter med ETP eller MCT över cut-off och utveckling av DIC / # patienter med positiv DIC-poäng. Det prediktiva värdet för en negativ DIC-poäng kommer att beräknas med formeln: # patienter med ETP eller MCT under cut-off och ingen progression till DIC / # patienter med negativ DIC-poäng.

Specifikt mål #2: En multivariat analys kommer att göras för att bestämma vilka av prediktorvariablerna (ETP, MCT, Pro C, Pro S, ATIII, FVL, ProG20210A, DIC) som är associerade med de sekundära dikotoma utfallsmåtten: organdysfunktion vid 28 dagar (alla/ingen), 28 dagars dödlighet (död/levande).