Geração de trombina e tromboelastografia em CIVD não evidente

A ativação do sistema de coagulação ocorre precocemente em pacientes com sepse, embora a coagulação intravascular disseminada (DIC) clinicamente evidente seja identificada em apenas uma minoria de pacientes com sepse grave. A ativação descontrolada do sistema de coagulação pode contribuir para a fisiopatologia da falência de múltiplos órgãos e a subsequente morbidade e mortalidade da sepse. A identificação de fatores de risco que predizem a progressão para sepse grave e DIC tem sido difícil. Propomos que os ensaios de sangue total e de coagulação rica em células oferecerão maior sensibilidade às alterações pró-coagulantes e anticoagulantes que ocorrem no início da sepse e melhorarão o reconhecimento da CID não evidente. Estudos futuros irão abordar se esses ensaios têm valor preditivo suficientemente alto para identificar subgrupos de pacientes que poderiam se beneficiar da intervenção precoce.

Objetivos Específicos:

1. Nossa hipótese é que o aumento da geração de trombina precederá o desenvolvimento de DIC evidente por um período de tempo clinicamente significativo. Nosso objetivo primário é determinar se o potencial de trombina endógena medido no primeiro diagnóstico de sepse antes do início da DIC e falência de órgãos é preditivo de DIC evidente.
2. Existe uma variação individual significativa entre a população saudável na geração endógena de trombina devido a polimorfismos conhecidos e desconhecidos nas proteínas de coagulação. Prevemos que as variáveis ​​do hospedeiro na geração de trombina contribuirão para a suscetibilidade à DIC e mau prognóstico durante a sepse. Um objetivo secundário deste estudo é determinar se as variáveis ​​de coagulação do hospedeiro predispõem à morbidade e mortalidade associadas à sepse.

Desenho Experimental e Métodos

O desenho do estudo será um estudo observacional prospectivo de pacientes que se apresentam ao Departamento de Emergência do Hospital Memorial Hermann com sepse. Os critérios para sepse incluem evidências de síndrome de resposta inflamatória sistêmica, conforme definido pela Conferência de Consenso ACCP/SCCM, e uma infecção conhecida ou suspeita. Os critérios de exclusão incluem sinais de sepse grave ou choque séptico, conforme definido pela ACCP/SCCM Consensus Conference, na apresentação, incluindo: disfunção de órgãos, hipoperfusão e anormalidades de perfusão. Condições médicas crônicas associadas à imunossupressão ou coagulopatias, como neutropenia e doença falciforme, e uso de medicamentos que levam a disfunção imunológica ou coagulopatias, como uso crônico de esteroides ou anticoagulação, também serão motivos de exclusão. Além disso, devido ao volume de sangue necessário de cada paciente para estudos laboratoriais, apenas pacientes com 25 kg de peso corporal ou mais serão incluídos. A retirada do estudo ficará a critério do médico assistente ou sujeito. Todos os esforços serão feitos para coletar informações clínicas de pacientes que desistiram.

Critério de inclusão

• Infecção conhecida ou suspeita conforme determinado pelo médico assistente Paciente a ser internado no hospital
• Síndrome de Resposta Inflamatória Sistêmica: 3 dos 4 critérios a seguir:
• Temperatura > 38 C ou < 35 C
• Frequência cardíaca > 90 batimentos/min, exceto em pacientes com uma condição médica conhecida por aumentar a frequência cardíaca ou naqueles recebendo tratamento que previna a taquicardia.
• Frequência respiratória > 20 respirações/min ou PaC02 < 32 mmHg, ou em ventilação mecânica para processo respiratório agudo.
• Contagem de glóbulos brancos > 12.000/mm3, < 4.000/mm3 ou > 10% de bandas

Critério de exclusão

• - Uso das seguintes medicações: heparina não fracionada para tratamento de evento trombótico ativo até 8 horas antes da infusão; heparina de baixo peso molecular em dose maior do que a recomendada para uso profilático dentro de 12 horas antes da infusão, varfarina usada dentro de 7 dias após a entrada no estudo, uso de aspirina em dose superior a 650 mg/dia dentro de 3 dias antes do estudo, terapia trombolítica dentro de 3 dias antes do estudo, antagonistas da glicoproteína IIb/IIIa dentro de 7 dias antes da entrada no estudo, administração de proteína C ativada (Xigris ) nas 24 horas antes da entrada no estudo.
• Neutropenia
• Hemofilia
• Cetoacidose diabética
• Peso < 25 kg

Os pacientes serão inscritos no departamento de emergência dentro de 2 horas após a elegibilidade da reunião. O consentimento informado por escrito será obtido dos pacientes ou de seus representantes autorizados. Amostras de sangue serão coletadas por punção venosa periférica durante a primeira hora após a inscrição e, em seguida, uma vez ao dia durante 7 dias (consulte o Apêndice A).

Os pacientes serão retirados do estudo se a coleta de sangue não for realizada dentro de 2 horas após a obtenção do consentimento informado.

Coleta de dados clínicos Os formulários de dados clínicos (consulte o Apêndice B) serão preenchidos no momento da inscrição e diariamente durante 7 dias, na alta hospitalar e aos 28 dias. Os médicos serão cegos para os resultados dos testes de laboratório de pesquisa.

Métodos de Laboratório

Sangue e plasma Cada paciente terá 15 ml de sangue coletados no momento da inscrição. Os espécimes serão obtidos por punção venosa antecubital. Será empregado fluxo livre ou sucção mínima; recipientes a vácuo serão evitados. As amostras para análise de plasma pobre em plaquetas (PPP) e sangue total serão coletadas em tubos de vidro siliconizados com citrato trissódico 0,105M na proporção de 1 parte de anticoagulante para 9 partes de sangue total. O PPP será separado em 60 minutos e analisado imediatamente. As amostras de plasma rico em plaquetas (PRP) serão separadas dos ¾ do volume superior do sobrenadante do plasma após centrifugação a 265g por 10 minutos em temperatura ambiente. As plaquetas serão contadas em contador Beckman Coulter e ajustadas para 150 X 109 plaquetas/l com PPP autólogo. O PRP será usado em 60 minutos. A análise de Cbc, PT/PTT, fibrinogênio, d-dímero, atividade da proteína C, atividade da proteína S, atividade ATIII, mutação do fator V de Leiden, mutação da protrombina G20210A será realizada nos laboratórios clínicos do Memorial Herman Hospital.

RoTEG

Amostras de sangue total serão coletadas conforme descrito acima. As medições serão realizadas em dois analisadores de coagulação roTEG da Pentapharm. Os copos de reação totalmente em plástico RoTEG são adquiridos do fabricante. Pipetas de polipropileno e polietileno são utilizadas para manipular reagentes e sangue. O sangue total citratado será recalcificado por 20 mcl 0,2 mol/L CaCl2 e ativado por 20 mcl de solução de TF humano recombinante (Innovin) diluído 1:1000 usando um tampão de barbital sódico. Os parâmetros medidos foram definidos pelo fabricante da seguinte forma: O tempo de coagulação (CT) é o tempo em segundos desde a ativação da coagulação do Ca2+ até que um aumento na elasticidade correspondente a 2 mm gráfico seja obtido na ordenada. O tempo de formação do coágulo (CFT) é o tempo em segundos que passa enquanto a elasticidade aumenta de 2 mm para 20 mm na ordenada. A formação máxima de coágulo (MCF) expressa a resistência máxima em milímetros do coágulo final. Vários parâmetros adicionais representando o registro contínuo da formação do coágulo foram definidos por Sorensen et al 28: a velocidade máxima (MaxVel) da formação do coágulo, o tempo até a velocidade máxima (T,MaxVel) da formação do coágulo e a área sob a curva de velocidade (AUC).

Geração de Trombina

Medições de geração de trombina automatizadas calibradas serão realizadas usando a metodologia Hemker. 29 O plasma rico em plaquetas (PRP) será preparado conforme descrito acima. O substrato fluorogênico e a trombina cromogênica serão adquiridos através da Thermolabsystems, e o fator tecidual relipidado recombinante (TF) através da Dade Behring. O complexo alfa 2 macroglobulina-trombina usado como calibrador será adquirido através da Thrombolabsystems. Os trombogramas serão medidos em fluorômetro de placas de 96 poços (leitor Ascent, Thrombolabsystems) e analisados ​​com software adquirido através da Thrombinoscope. Os experimentos serão realizados em quadruplicata e comparados a um calibrador. A cada poço serão adicionados 80 mcl de plasma, seguido do calibrador ou tampão, depois o "gatilho": 20 mcl de 3 mM de TF. A placa será colocada no fluorômetro e aquecida a 37 C. O instrumento dispensa 20 mcl de substrato fluorogênico 2,5 mM e CaCl2 100 mM (FluCa) para todos os poços a serem medidos, registra isso como tempo zero, agita-os por 10 s e inicia a leitura. Durante a medição, o programa compara as leituras do TG e do CL, calcula a concentração de trombina e exibe a concentração de trombina no tempo. O pico de trombina é a maior concentração de trombina alcançada durante o curso de tempo de formação e inibição de trombina. O potencial de trombina é a quantidade de trombina que se forma em 60 minutos (Área sob a curva). A fase lag e o tempo de pico referem-se ao início e à velocidade de formação da trombina, respectivamente.

Gerenciamento de Dados Os dados serão coletados em formulários de papel que serão elaborados pela seção central de informática do GCRC. O núcleo de informática do GCRC manterá os dados em um banco de dados seguro (Access). Cada assunto receberá um ID exclusivo refletindo a ordem em que a inscrição ocorreu.

Análise e apresentação de dados

Este é um estudo piloto destinado a fornecer os dados preliminares para futuros estudos clínicos. Estatísticas descritivas serão usadas para caracterizar ETP e roTEG na apresentação inicial da sepse. Médias e intervalos serão relatados para cada uma das variáveis ​​no ensaio de geração de trombina (tempo de atraso, inclinação de aumento, valor de pico e área sob a curva) e roTEG (tempo de formação de coágulo (CFT), formação máxima de coágulo (MCF), velocidade máxima (MaxVel) de formação de coágulo, tempo para velocidade máxima (T,MaxVel) de formação de coágulo e área sob a curva de velocidade (AUC)). O objetivo principal deste estudo é comparar o ETP na apresentação com o desenvolvimento de DIC, conforme definido por um escore ISTH DIC positivo. O objetivo secundário será comparar as variáveis ​​de coagulação do hospedeiro, incluindo ETP, roTEG, Pro C, Pro S, ATIII, FVL e mutação da protrombina G20210A na apresentação, com as medidas de desfecho secundário de mortalidade em 28 dias e disfunção orgânica. Todas as estatísticas serão realizadas usando NCSS/PASS.

Determinação do tamanho da amostra: Não há relatos publicados de ensaios de geração de trombina ou tromboelastografia em sepse ou DIC. Em nossos estudos anteriores de pacientes tomando um anticoagulante (varfarina), houve um decréscimo de 400% de ETP (1719 para 404). Para derivar um ETP médio com largura alvo de 100 e intervalo de confiança de 95%, assumindo um desvio padrão de 259, precisaremos inscrever 100 pacientes.

Empregaremos os seguintes métodos estatísticos para a análise dos dados:

Objetivo Específico #1: O potencial endógeno de trombina (ETP) é a área sob a curva do ensaio de geração de trombina. Os valores são contínuos e variam de 0 a 2.500. A formação máxima de coágulo (MCF) do roTEG também será usada para aproximar o ETP. O escore DIC será calculado e codificado como uma variável dicotômica: Sim (escore > 5) ou Não (escore < 5). Uma curva operacional do receptor será derivada para ETP e MCT e sua sensibilidade e especificidade para prever DIC. Se a área sob a curva for significativa, um valor de corte ideal com o maior grau de precisão será escolhido. Este valor será usado para estimar o valor preditivo do teste. O valor preditivo positivo será calculado com a fórmula: # pacientes com ETP ou MCT acima do ponto de corte e desenvolvimento de DIC / # pacientes com pontuação DIC positiva. O valor preditivo de um escore DIC negativo será calculado usando a fórmula: # pacientes com ETP ou MCT abaixo do ponto de corte e sem progressão para DIC / # pacientes com escore DIC negativo.

Objetivo Específico #2: Uma análise multivariada será feita para determinar quais das variáveis ​​preditoras (ETP, MCT, Pro C, Pro S, ATIII, FVL, ProG20210A, DIC) estão associadas com as medidas de resultado dicotômicas secundárias: disfunção orgânica aos 28 dias (qualquer/nenhum), mortalidade de 28 dias (morto/vivo).