Generování trombinu a tromboelastografie v non-overt DIC

K aktivaci koagulačního systému dochází časně u pacientů se sepsí, ačkoli klinicky zjevná diseminovaná intravaskulární koagulace (DIC) je identifikována pouze u menšiny pacientů s těžkou sepsí. Nekontrolovaná aktivace koagulačního systému může přispět k patofyziologii mnohočetného orgánového selhání a následné morbiditě a mortalitě sepse. Identifikace rizikových faktorů predikujících progresi do těžké sepse a DIC byla v nedohlednu. Navrhujeme, aby testy plné krve a koagulace bohaté na buňky nabídly zlepšenou citlivost na prokoagulační i antikoagulační změny, ke kterým dochází v časných stádiích sepse, a zlepší rozpoznání nezjevného DIC. Budoucí studie se budou zabývat tím, zda tyto testy mají dostatečně vysokou prediktivní hodnotu pro identifikaci podskupin pacientů, kteří by mohli mít prospěch z včasné intervence.

Konkrétní cíle:

1. Předpokládáme, že zvýšená tvorba trombinu bude předcházet rozvoji zjevné DIC o klinicky významné časové období. Naším primárním cílem je určit, zda endogenní trombinový potenciál měřený při první diagnóze sepse před nástupem DIC a orgánového selhání je prediktivní pro zjevnou DIC.
2. Mezi zdravou populací existují významné individuální rozdíly v tvorbě endogenního trombinu v důsledku známých i neznámých polymorfismů v koagulačních proteinech. Předpokládáme, že hostitelské proměnné v tvorbě trombinu budou přispívat k náchylnosti k DIC a špatnému výsledku během sepse. Sekundárním cílem této studie je určit, zda proměnné koagulace hostitele predisponují k morbiditě a mortalitě spojené se sepsí.

Experimentální design a metody

Design studie bude prospektivní observační studie pacientů přicházejících na urgentní příjem nemocnice Memorial Hermann se sepsí. Kritéria pro sepsi zahrnují důkazy o syndromu systémové zánětlivé odpovědi, jak je definován na ACCP/SCCM Consensus Conference, a známé nebo suspektní infekci. Kritéria vyloučení zahrnují známky těžké sepse nebo septického šoku, jak je definovala ACCP/SCCM Consensus Conference, při prezentaci, včetně: orgánové dysfunkce, hypoperfuze a abnormalit perfuze. Chronické zdravotní stavy spojené s potlačením imunity nebo koagulopatiemi, jako je neutropenie a srpkovitá anémie, a užívání léků vedoucích k imunitní dysfunkci nebo koagulopatiím, jako je chronické užívání steroidů nebo antikoagulace, budou také důvodem k vyloučení. Navíc, vzhledem k objemu krve vyžadovanému od každého pacienta pro laboratorní studie, budou zařazeni pouze pacienti s tělesnou hmotností 25 kg nebo více. Odstoupení ze studie bude na uvážení ošetřujícího lékaře nebo subjektu. Bude vynaloženo veškeré úsilí na sběr klinických informací od pacientů, kteří se stáhli.

Kritéria pro zařazení

• Známá nebo suspektní infekce, jak určí ošetřující lékař Pacient musí být přijat do nemocnice
• Syndrom systémové zánětlivé odpovědi: 3 z následujících 4 kritérií:
• Teplota > 38 C nebo < 35 C
• Srdeční frekvence > 90 tepů/min, s výjimkou pacientů se zdravotním stavem, o kterém je známo, že zvyšuje srdeční frekvenci, nebo pacientů, kteří dostávají léčbu, která by zabránila tachykardii.
• Dechová frekvence > 20 dechů/min nebo PaC02 < 32 mmHg, nebo na mechanické ventilaci pro akutní respirační proces.
• Počet bílých krvinek > 12 000/mm3, < 4 000/mm3 nebo > 10 % pásů

Kritéria vyloučení

• - Použití následujících léků: nefrakcionovaný heparin k léčbě aktivní trombotické příhody během 8 hodin před infuzí; nízkomolekulární heparin ve vyšší dávce, než je doporučeno pro profylaktické použití do 12 hodin před infuzí, warfarin použitý do 7 dnů od vstupu do studie, užití aspirinu v dávce vyšší než 650 mg/den do 3 dnů před zahájením studie, trombolytická terapie do 3 dnů před zahájením studie, antagonisté glykoproteinu IIb/IIIa do 7 dnů před vstupem do studie, podání aktivovaného proteinu C (Xigris ) během 24 hodin před vstupem do studie.
• Neutropenie
• Hemofilie
• Diabetická ketoacidóza
• Hmotnost < 25 kg

Pacienti budou zařazeni na pohotovost do 2 hodin od splnění způsobilosti. Od pacientů nebo jejich oprávněných zástupců bude získán písemný informovaný souhlas. Vzorky krve budou odebírány periferní venepunkcí během první hodiny po zařazení a poté jednou denně po dobu 7 dnů (viz Příloha A).

Pacienti budou ze studie vyřazeni, pokud se odběr krve neprovede do 2 hodin od získání informovaného souhlasu.

Sběr klinických údajů Formuláře klinických údajů (viz Příloha B) budou vyplněny v době zápisu a denně po dobu 7 dnů, při propuštění z nemocnice a po 28 dnech. Kliničtí lékaři budou slepí k výsledkům výzkumných laboratorních testů.

Laboratorní metody

Krev a plazma Každému pacientovi bude při registraci odebráno 15 ml krve. Vzorky budou získány přednožní venepunkcí. Bude použit volný průtok nebo minimální sání; vakuové nádoby se vyhnou. Vzorky pro analýzu plazmy chudé na destičky (PPP) a plné krve budou odebírány do silikonizovaných skleněných zkumavek s 0,105M citrátem sodným v poměru 1 díl antikoagulantu na 9 dílů plné krve. PPP bude separován do 60 minut a okamžitě analyzován. Vzorky plazmy bohaté na destičky (PRP) budou odděleny od horních ¾ objemu supernatantu plazmy po centrifugaci při 265 g po dobu 10 minut při pokojové teplotě. Krevní destičky se spočítají na počítači Beckman Coulter a upraví se na 150 x 109 destiček/l pomocí autologního PPP. PRP bude použito do 60 minut. Cbc, PT/PTT, Fibrinogen, d-dimer, aktivita proteinu C, aktivita proteinu S, aktivita ATIII, mutace faktoru V Leiden, analýza mutace protrombinu G20210A bude provedena v klinických laboratořích nemocnice Memorial Herman.

RoTEG

Vzorky plné krve budou odebrány, jak je popsáno výše. Měření budou provedena na dvou koagulačních analyzátorech roTEG od Pentapharm. Celoplastové reakční kelímky RoTEG jsou pořizovány u výrobce. Pro manipulaci s činidly a krví se používají pipety z polypropylenu a polyetylénu. Citrátovaná plná krev bude rekalcifikována 20 mcl 0,2 mol/l CaCl2 a aktivována 20 mcl roztoku rekombinantního lidského TF (Innovin) zředěného 1:1000 za použití barbitalového pufru sodného. Naměřené parametry byly výrobcem definovány následovně: Doba srážení (CT) je doba v sekundách od aktivace koagulace Ca2+ až do zvýšení elasticity odpovídající 2 grafickým mm na ose y. Doba tvorby sraženiny (CFT) je doba v sekundách, která uplyne, zatímco se elasticita zvýší z 2 mm na 20 mm na ose y. Maximální tvorba sraženiny (MCF) vyjadřuje maximální pevnost v milimetrech konečné sraženiny. Několik dalších parametrů představujících kontinuální registraci tvorby sraženiny bylo definováno Sorensenem et al 28: maximální rychlost (MaxVel) tvorby sraženiny, doba do maximální rychlosti (T,MaxVel) tvorby sraženiny a plocha pod křivkou rychlosti (AUC).

Generace trombinu

Kalibrovaná automatizovaná měření tvorby trombinu budou prováděna pomocí Hemkerovy metodiky. 29 Plazma bohatá na destičky (PRP) bude připravena tak, jak je popsáno výše. Fluorogenní substrát a chromogenní trombin budou zakoupeny prostřednictvím společnosti Thermolabsystems a rekombinantní relipidovaný tkáňový faktor (TF) prostřednictvím společnosti Dade Behring. komplex alfa 2 makroglobulin-trombin používaný jako kalibrátor bude zakoupen prostřednictvím Thrombolabsystems. Trombogramy budou měřeny na 96jamkovém destičkovém fluorometru (Ascent reader, Thrombolabsystems) a analyzovány pomocí softwaru zakoupeného prostřednictvím Thrombinoscope. Experimenty budou provedeny ve čtyřech opakováních a budou porovnány s kalibrátorem. Do každé jamky se přidá 80 mcl plazmy, poté kalibrátor nebo pufr, poté "spouštěč": 20 mcl 3 mM TF. Destička se vloží do fluorometru a nechá se zahřát na 37 C. Přístroj nadávkuje 20 mcl fluorogenního substrátu 2,5 mM a CaCl2 100 mM (FluCa) do všech jamek, které mají být měřeny, zaznamená to jako nulový čas, protřepává jimi po dobu 10 s a začne odečítat. Během měření program porovnává naměřené hodnoty z TG a CL, vypočítává koncentraci trombinu a zobrazuje koncentraci trombinu v čase. Vrchol trombinu je nejvyšší koncentrace trombinu dosažená během časového průběhu tvorby a inhibice trombinu. Potenciál trombinu je množství trombinu, které se vytvoří během 60 minut (plocha pod křivkou). Fáze zpoždění a doba vrcholu se vztahují k začátku a rychlosti tvorby trombinu.

Správa dat Data budou shromažďována na papírových formulářích, které budou navrženy základní sekcí informatiky GCRC. Informatické jádro GCRC bude udržovat data v zabezpečené databázi (Access). Každému subjektu bude přiděleno jedinečné ID odrážející pořadí, ve kterém zápis probíhal.

Analýza a prezentace dat

Jedná se o pilotní studii, která má poskytnout předběžná data pro budoucí klinické studie. Deskriptivní statistika bude použita k charakterizaci ETP a roTEG při počáteční prezentaci sepse. Průměry a rozsahy budou uvedeny pro každou z proměnných v testu tvorby trombinu (doba zpoždění, sklon vzestupu, maximální hodnota a plocha pod křivkou) a roTEG (doba tvorby sraženiny (CFT), maximální tvorba sraženiny (MCF), max. maximální rychlost (MaxVel) tvorby sraženiny, doba do maximální rychlosti (T,MaxVel) tvorby sraženiny a plocha pod křivkou rychlosti (AUC)). Primárním cílem této studie je porovnat ETP při prezentaci s rozvojem DIC, jak je definováno pozitivním skóre ISTH DIC. Sekundárním cílem bude porovnat proměnné koagulace hostitele, včetně ETP, roTEG, Pro C, Pro S, ATIII, FVL a mutace protrombinu G20210A při prezentaci, se sekundárními výslednými ukazateli 28denní mortality a orgánové dysfunkce. Všechny statistiky budou prováděny pomocí NCSS/PASS.

Stanovení velikosti vzorku: Neexistují žádné publikované zprávy o stanovení tvorby trombinu nebo tromboelastografii u sepse nebo DIC. V našich předchozích studiích pacientů užívajících antikoagulancium (warfarin) došlo ke 400% poklesu ETP (1719 až 404). Abychom odvodili střední ETP s cílovou šířkou 100 a 95% intervalem spolehlivosti, za předpokladu standardní odchylky 259, budeme muset zapsat 100 pacientů.

Pro analýzu dat použijeme následující statistické metody:

Specifický cíl č. 1: Endogenní trombinový potenciál (ETP) je oblast pod křivkou testu tvorby trombinu. Hodnoty jsou spojité a pohybují se od 0 do 2 500. Maximální tvorba sraženiny (MCF) z roTEG bude také použita k aproximaci ETP. Skóre DIC bude vypočítáno a kódováno jako dichotomická proměnná: Ano (skóre > 5) nebo Ne (skóre < 5). Bude odvozena provozní křivka přijímače pro ETP a MCT a jejich citlivost a specificita pro predikci DIC. Pokud se zjistí, že oblast pod křivkou je významná, zvolí se optimální mezní hodnota s nejvyšším stupněm přesnosti. Tato hodnota bude použita k odhadu prediktivní hodnoty testu. Pozitivní prediktivní hodnota bude vypočtena podle vzorce: # pacientů s ETP nebo MCT nad mezní hodnotou a rozvojem DIC / # pacientů s pozitivním skóre DIC. Prediktivní hodnota negativního skóre DIC bude vypočtena pomocí vzorce: # pacientů s ETP nebo MCT pod mezní hodnotou a bez progrese do DIC / # pacientů s negativním skóre DIC.

Specifický cíl č. 2: Bude provedena multivariační analýza, aby se určilo, které z prediktorových proměnných (ETP, MCT, Pro C, Pro S, ATIII, FVL, ProG20210A, DIC) jsou spojeny se sekundárními dichotomickými výslednými měřítky: orgánová dysfunkce ve 28. dnů (jakýkoli/žádný), 28denní úmrtnost (mrtvý/živý).