Trombinegeneratie en trombo-elastografie bij niet-openlijke DIC

Activering van het coagulatiesysteem vindt vroeg plaats bij patiënten met sepsis, hoewel klinisch openlijke gedissemineerde intravasculaire coagulatie (DIC) slechts bij een minderheid van patiënten met ernstige sepsis wordt vastgesteld. Ongecontroleerde activering van het stollingssysteem kan bijdragen aan de pathofysiologie van meervoudig orgaanfalen en de daaropvolgende morbiditeit en mortaliteit van sepsis. Identificatie van risicofactoren die de progressie naar ernstige sepsis en DIC voorspellen, was ongrijpbaar. We stellen voor dat volbloed- en celrijke stollingstesten een verbeterde gevoeligheid zullen bieden voor zowel de procoagulante als anticoagulante veranderingen die vroeg in sepsis optreden en de herkenning van niet-openlijke DIC zullen verbeteren. Toekomstige studies zullen nagaan of deze assays een voldoende hoge voorspellende waarde hebben om subgroepen van patiënten te identificeren die baat zouden kunnen hebben bij vroegtijdige interventie.

Specifieke doelstellingen:

1. We veronderstellen dat een verhoogde vorming van trombine vooraf zal gaan aan de ontwikkeling van openlijke DIC met een klinisch significante tijdsperiode. Ons primaire doel is om te bepalen of het endogene trombinepotentieel, gemeten bij de eerste diagnose van sepsis voorafgaand aan het begin van DIC en orgaanfalen, voorspellend is voor openlijke DIC.
2. Er is een significante individuele variatie onder de gezonde populatie wat betreft endogene trombineproductie als gevolg van bekende en onbekende polymorfismen in stollingseiwitten. We voorspellen dat gastheervariabelen bij het genereren van trombine zullen bijdragen aan de gevoeligheid voor DIC en een slecht resultaat tijdens sepsis. Een secundair doel van deze studie is om te bepalen of gastheercoagulatievariabelen predisponeren voor de morbiditeit en mortaliteit geassocieerd met sepsis.

Experimenteel ontwerp en methoden

De opzet van de studie zal een prospectieve observationele studie zijn van patiënten die zich met sepsis presenteren op de afdeling Spoedeisende Hulp van het Memorial Hermann Hospital. Criteria voor sepsis omvatten bewijs van systemisch inflammatoir responssyndroom zoals gedefinieerd door de ACCP/SCCM-consensusconferentie, en een bekende of vermoede infectie. Uitsluitingscriteria omvatten tekenen van ernstige sepsis of septische shock, zoals gedefinieerd door de ACCP/SCCM-consensusconferentie, bij presentatie, waaronder: orgaandisfunctie, hypoperfusie en perfusieafwijkingen. Chronische medische aandoeningen die verband houden met immuunsuppressie of coagulopathieën, zoals neutropenie en sikkelcelanemie, en het gebruik van medicijnen die leiden tot immuundisfunctie of coagulopathieën, zoals chronisch gebruik van steroïden of anticoagulantia, zullen ook redenen zijn voor uitsluiting. Bovendien zullen, vanwege het bloedvolume dat van elke patiënt nodig is voor laboratoriumonderzoek, alleen patiënten met een lichaamsgewicht van 25 kg of meer worden ingeschreven. Terugtrekking uit het onderzoek is ter beoordeling van de behandelend arts of proefpersoon. Alles zal in het werk worden gesteld om klinische informatie te verzamelen van patiënten die zich hebben teruggetrokken.

Inclusiecriteria

• Bekende of vermoede infectie zoals bepaald door de behandelend arts Patiënt die wordt opgenomen in het ziekenhuis
• Systemisch ontstekingsreactiesyndroom: 3 van de volgende 4 criteria:
• Temperatuur > 38 C of < 35 C
• Hartslag > 90 slagen/min, behalve bij patiënten met een medische aandoening waarvan bekend is dat ze de hartslag verhogen of bij patiënten die een behandeling ondergaan die tachycardie zou voorkomen.
• Ademhalingsfrequentie > 20 ademhalingen/min of PaC02 < 32 mmHg, of op mechanische beademing voor een acuut ademhalingsproces.
• Aantal witte bloedcellen > 12.000/mm3, < 4.000/mm3 of > 10%-banden

Uitsluitingscriteria

• - Gebruik van de volgende geneesmiddelen: ongefractioneerde heparine om een ​​actief trombotisch voorval te behandelen binnen 8 uur vóór de infusie; laagmoleculaire heparine in een hogere dosis dan aanbevolen voor profylactisch gebruik binnen 12 uur vóór de infusie, warfarine gebruikt binnen 7 dagen na aanvang van het onderzoek, aspirinegebruik in een dosis van meer dan 650 mg/dag binnen 3 dagen vóór het onderzoek, trombolytische therapie binnen 3 dagen vóór het onderzoek, glycoproteïne IIb/IIIa-antagonisten binnen 7 dagen vóór het begin van het onderzoek, toediening van geactiveerd proteïne C (Xigris) in de 24 uur vóór het begin van het onderzoek.
• Neutropenie
• Hemofilie
• Diabetische ketoacidose
• Gewicht < 25 kg

Patiënten worden binnen 2 uur ingeschreven op de afdeling spoedeisende hulp nadat ze in aanmerking zijn gekomen. Schriftelijke geïnformeerde toestemming zal worden verkregen van de patiënten of hun gemachtigde vertegenwoordigers. Bloedmonsters worden afgenomen door middel van perifere venapunctie gedurende het eerste uur na inschrijving en daarna eenmaal per dag gedurende 7 dagen (zie Bijlage A).

Patiënten zullen uit het onderzoek worden teruggetrokken als er geen bloedafname wordt uitgevoerd binnen 2 uur na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming.

Verzameling van klinische gegevens Formulieren met klinische gegevens (zie Bijlage B) worden ingevuld op het moment van inschrijving en dagelijks gedurende 7 dagen, bij ontslag uit het ziekenhuis en na 28 dagen. Clinici zullen blind zijn voor de resultaten van de laboratoriumtests.

Laboratoriummethoden

Bloed en plasma Bij elke patiënt wordt bij inschrijving 15 ml bloed afgenomen. Specimens zullen worden verkregen via antecubitale venapunctie. Vrije stroming of minimale zuigkracht wordt gebruikt; vacuümcontainers worden vermeden. Specimens voor bloedplaatjesarm plasma (PPP) en volbloedanalyse zullen worden verzameld in gesiliconiseerde glazen buisjes met 0,105 M trinatriumcitraat in de verhouding van 1 deel antistollingsmiddel op 9 delen volbloed. PPP wordt binnen 60 minuten gescheiden en direct geanalyseerd. Monsters met bloedplaatjesrijk plasma (PRP) worden gescheiden van het bovenste ¾ volume plasmasupernatant na centrifugatie bij 265 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. De bloedplaatjes worden geteld op een Beckman Coulter-teller en aangepast tot 150 x 109 bloedplaatjes/l met autologe PPP. PRP wordt binnen 60 minuten gebruikt. Cbc, PT/PTT, fibrinogeen, d-dimeer, Proteïne C-activiteit, Proteïne S-activiteit, ATIII-activiteit, Factor V Leiden-mutatie, Protrombine G20210A-mutatieanalyse zal worden uitgevoerd in de klinische laboratoria van Memorial Herman Hospital.

RoTEG

Volbloedmonsters worden afgenomen zoals hierboven beschreven. Metingen worden uitgevoerd op twee roTEG Coagulation Analyzers van Pentapharm. RoTEG volledig plastic reactiebekers worden bij de fabrikant gekocht. Pipetten van polypropyleen en polyethyleen worden gebruikt om reagentia en bloed te hanteren. Volbloed met citraat wordt opnieuw verkalkt met 20 mcl 0,2 mol/L CaCl2 en geactiveerd door 20 mcl oplossing van recombinant humaan TF (Innovin) 1:1000 verdund met behulp van een natriumbarbitalbuffer. De gemeten parameters zijn door de fabrikant als volgt gedefinieerd: De stollingstijd (CT) is de tijd in seconden vanaf Ca2+-activering van coagulatie en totdat een toename in elasticiteit overeenkomend met 2 grafische mm wordt verkregen op de ordinaat. De stolselvormingstijd (CFT) is de tijd in seconden die verstrijkt terwijl de elasticiteit toeneemt van 2 mm naar 20 mm op de ordinaat. De maximale stolselvorming (MCF) drukt de maximale sterkte uit in millimeters van het uiteindelijke stolsel. Verschillende aanvullende parameters die de continue registratie van stolselvorming vertegenwoordigen, zijn gedefinieerd door Sorensen et al 28: de maximale snelheid (MaxVel) van stolselvorming, de tijd tot maximale snelheid (T,MaxVel) van stolselvorming en het gebied onder de snelheidscurve. (AUC).

Trombine generatie

Gekalibreerde geautomatiseerde trombinegeneratiemetingen zullen worden uitgevoerd met behulp van de Hemker-methodologie. 29 Bloedplaatjesrijk plasma (PRP) zal worden bereid zoals hierboven beschreven. Fluorogeen substraat en chromogene trombine zullen worden gekocht via Thermolabsystems en recombinant relipidated tissue factor (TF) via Dade Behring. alpha 2 macroglobuline-trombinecomplex gebruikt als kalibrator zal worden gekocht via Thrombolabsystems. De trombogrammen worden gemeten in een fluorometer met 96 putjes (Ascent-lezer, Thrombolabsystems) en geanalyseerd met software die via Thrombinoscope is gekocht. Experimenten worden in viervoud uitgevoerd en vergeleken met een kalibrator. Aan elk putje wordt 80 mcl plasma toegevoegd, gevolgd door de kalibrator of buffer, dan de "trigger": 20 mcl van 3 mM TF. De plaat wordt in de fluorometer geplaatst en opgewarmd tot 37 C. Het instrument geeft 20 mcl Fluorogeen substraat 2,5 mM en CaCl2 100 mM (FluCa) af aan alle te meten wells, registreert dit als nultijd, schudt ze gedurende 10 seconden en begint met lezen. Tijdens de meting vergelijkt het programma de waarden van de TG en de CL, berekent de trombineconcentratie en geeft de trombineconcentratie in de tijd weer. De piektrombine is de hoogste trombineconcentratie die wordt bereikt tijdens het tijdsverloop van trombinevorming en remming. Het trombinepotentieel is de hoeveelheid trombine die binnen 60 minuten wordt gevormd (gebied onder de curve). De vertragingsfase en de piektijd verwijzen respectievelijk naar het begin en de snelheid van trombinevorming.

Gegevensbeheer Gegevens worden verzameld op papieren formulieren die worden ontworpen door de GCRC-informatica-kernsectie. De informaticakern van het GCRC houdt gegevens bij in een beveiligde database (Access). Elk onderwerp krijgt een uniek ID toegewezen dat de volgorde weerspiegelt waarin de inschrijving plaatsvond.

Gegevensanalyse en presentatie

Dit is een pilootstudie die bedoeld is om de voorlopige gegevens te verstrekken voor toekomstige klinische studies. Beschrijvende statistiek zal worden gebruikt om ETP en roTEG te karakteriseren bij de eerste presentatie van sepsis. Middelen en bereiken zullen worden gerapporteerd voor elk van de variabelen in de trombinegeneratietest (vertragingstijd, helling van de stijging, piekwaarde en gebied onder de curve) en roTEG (stolselvormingstijd (CFT), maximale stolselvorming (MCF), maximale snelheid (MaxVel) van stolselvorming, tijd tot maximale snelheid (T,MaxVel) van stolselvorming en oppervlakte onder de snelheidscurve (AUC)). Het primaire doel van deze studie is om ETP bij presentatie te vergelijken met de ontwikkeling van DIC, zoals gedefinieerd door een positieve ISTH DIC-score. Het secundaire doel zal zijn om gastcoagulatievariabelen, waaronder ETP, roTEG, Pro C, Pro S, ATIII, FVL en protrombine G20210A-mutatie bij presentatie, te vergelijken met de secundaire uitkomstmaten van 28-dagen mortaliteit en orgaandisfunctie. Alle statistieken worden uitgevoerd met behulp van NCSS/PASS.

Bepaling van de steekproefomvang: Er zijn geen gepubliceerde rapporten van trombinegeneratie-assays of trombo-elastografie bij sepsis of DIC. In onze eerdere onderzoeken met patiënten die een antistollingsmiddel (warfarine) gebruikten, was er een afname van 400% van ETP (1719 tot 404). Om een ​​gemiddelde ETP af te leiden met een doelbreedte van 100 en een betrouwbaarheidsinterval van 95%, uitgaande van een standaarddeviatie van 259, moeten we 100 patiënten inschrijven.

We gebruiken de volgende statistische methoden voor de analyse van gegevens:

Specifiek doel #1: Het endogene trombinepotentieel (ETP) is het gebied onder de kromme van de trombinegeneratietest. De waarden zijn continu en variëren van 0 tot 2.500. Maximale stolselvorming (MCF) van de roTEG zal ook worden gebruikt om ETP te benaderen. De DIC-score wordt berekend en gecodeerd als een dichotome variabele: Ja (score > 5) of Nee (score < 5). Er zal een receiver operating curve worden afgeleid voor ETP en MCT en de gevoeligheid en specificiteit ervan voor het voorspellen van DIC. Als het gebied onder de curve significant blijkt te zijn, wordt een optimale afkapwaarde met de hoogste mate van nauwkeurigheid gekozen. Deze waarde wordt gebruikt om de voorspellende waarde van de test te schatten. Positief voorspellende waarde wordt berekend met de formule: # patiënten met ETP of MCT boven de grenswaarde en ontwikkeling van DIC / # patiënten met positieve DIC-score. De voorspellende waarde van een negatieve DIC-score wordt berekend aan de hand van de formule: # patiënten met ETP of MCT onder de cut-off en geen progressie naar DIC / # patiënten met negatieve DIC-score.

Specifiek doel #2: Er zal een multivariate analyse worden uitgevoerd om te bepalen welke van de voorspellende variabelen (ETP, MCT, Pro C, Pro S, ATIII, FVL, ProG20210A, DIC) geassocieerd zijn met de secundaire dichotome uitkomstmaten: orgaandisfunctie op 28 dagen (Any/None), 28 dagen mortaliteit (Dead/Alive).