Generación de trombina y tromboelastografía en CID no manifiesta

La activación del sistema de coagulación ocurre temprano en pacientes con sepsis, aunque la coagulación intravascular diseminada (CID) clínicamente manifiesta se identifica solo en una minoría de pacientes con sepsis grave. La activación descontrolada del sistema de coagulación puede contribuir a la fisiopatología de la insuficiencia multiorgánica y la subsiguiente morbilidad y mortalidad de la sepsis. La identificación de los factores de riesgo que predicen la progresión a sepsis grave y DIC ha sido difícil de alcanzar. Proponemos que los ensayos de coagulación con sangre total y rica en células ofrezcan una mayor sensibilidad a los cambios procoagulantes y anticoagulantes que se producen en las primeras etapas de la sepsis y mejoren el reconocimiento de la CID no manifiesta. Los estudios futuros abordarán si estos ensayos tienen un valor predictivo suficientemente alto para identificar subgrupos de pacientes que podrían beneficiarse de una intervención temprana.

Objetivos específicos:

1. Presumimos que el aumento de la generación de trombina precederá al desarrollo de CID evidente por un período de tiempo clínicamente significativo. Nuestro objetivo principal es determinar si el potencial de trombina endógena medido en el primer diagnóstico de sepsis antes del inicio de la DIC y la insuficiencia orgánica es predictivo de DIC manifiesta.
2. Existe una variación individual significativa entre la población sana en la generación de trombina endógena debido a polimorfismos conocidos y desconocidos dentro de las proteínas de la coagulación. Predecimos que las variables del huésped en la generación de trombina contribuirán a la susceptibilidad a la DIC y al mal resultado durante la sepsis. Un objetivo secundario de este estudio es determinar si las variables de coagulación del huésped predisponen a la morbilidad y mortalidad asociadas con la sepsis.

Diseño Experimental y Métodos

El diseño del estudio será un estudio observacional prospectivo de pacientes que acuden al Departamento de Emergencias del Hospital Memorial Hermann con sepsis. Los criterios para la sepsis incluyen evidencia de síndrome de respuesta inflamatoria sistémica como lo define la Conferencia de Consenso ACCP/SCCM y una infección conocida o sospechada. Los criterios de exclusión incluyen signos de sepsis grave o shock séptico, según lo definido por la Conferencia de Consenso ACCP/SCCM, en la presentación, que incluyen: disfunción orgánica, hipoperfusión y anomalías en la perfusión. Las condiciones médicas crónicas asociadas con la inmunosupresión o coagulopatías, como la neutropenia y la enfermedad de células falciformes, y el uso de medicamentos que conducen a una disfunción inmunológica o coagulopatías, como el uso crónico de esteroides o la anticoagulación, también serán motivos de exclusión. Además, debido al volumen de sangre requerido de cada paciente para los estudios de laboratorio, solo se inscribirán pacientes de 25 kg de peso corporal o más. La retirada del estudio quedará a criterio del médico tratante o del sujeto. Se hará todo lo posible para recopilar información clínica de los pacientes que se hayan retirado.

Criterios de inclusión

• Infección conocida o sospechada según lo determine el médico tratante Paciente que será ingresado en el hospital
• Síndrome de Respuesta Inflamatoria Sistémica: 3 de los siguientes 4 criterios:
• Temperatura > 38 C o < 35 C
• Frecuencia cardíaca > 90 latidos/min, excepto en pacientes con una condición médica conocida por aumentar la frecuencia cardíaca o aquellos que reciben tratamiento para prevenir la taquicardia.
• Frecuencia respiratoria > 20 respiraciones/min o PaC02 < 32 mmHg, o en ventilación mecánica por un proceso respiratorio agudo.
• Recuento de glóbulos blancos > 12 000/mm3, < 4 000/mm3 o bandas > 10 %

Criterio de exclusión

• - Uso de los siguientes medicamentos: heparina no fraccionada para tratar un evento trombótico activo dentro de las 8 horas anteriores a la infusión; heparina de bajo peso molecular en una dosis más alta que la recomendada para uso profiláctico dentro de las 12 horas previas a la infusión, warfarina utilizada dentro de los 7 días previos al ingreso al estudio, uso de aspirina a una dosis de más de 650 mg/día dentro de los 3 días previos al estudio, terapia trombolítica dentro de los 3 días antes del estudio, antagonistas de la glicoproteína IIb/IIIa dentro de los 7 días antes del ingreso al estudio, administración de proteína C activada (Xigris) en las 24 horas antes del ingreso al estudio.
• Neutropenia
• Hemofilia
• Cetoacidosis diabética
• Peso < 25 kg

Los pacientes serán inscritos en el departamento de emergencias dentro de las 2 horas posteriores a la reunión de elegibilidad. Se obtendrá el consentimiento informado por escrito de los pacientes o de sus representantes autorizados. Las muestras de sangre se recolectarán mediante punción venosa periférica durante la primera hora después de la inscripción y luego una vez al día durante 7 días (consulte el Apéndice A).

Los pacientes serán retirados del estudio si la muestra de sangre no se realiza dentro de las 2 horas posteriores a la obtención del consentimiento informado.

Recopilación de datos clínicos Los formularios de datos clínicos (consulte el Apéndice B) se completarán en el momento de la inscripción y diariamente durante 7 días, al alta hospitalaria ya los 28 días. Los médicos no conocerán los resultados de las pruebas de laboratorio de investigación.

Métodos de laboratorio

Sangre y plasma A cada paciente se le extraerán 15 ml de sangre en el momento de la inscripción. Las muestras se obtendrán mediante venopunción antecubital. Se empleará flujo libre o succión mínima; Se evitarán los envases al vacío. Las muestras para análisis de plasma pobre en plaquetas (PPP) y sangre completa se recolectarán en tubos de vidrio siliconados con citrato trisódico 0,105 M en una proporción de 1 parte de anticoagulante por 9 partes de sangre completa. El PPP se separará en 60 minutos y se analizará de inmediato. Las muestras de plasma rico en plaquetas (PRP) se separarán de los ¾ del volumen superior del sobrenadante de plasma después de la centrifugación a 265 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las plaquetas se contarán en un contador Beckman Coulter y se ajustarán a 150 X 109 plaquetas/l con PPP autóloga. El PRP se utilizará en 60 minutos. Cbc, PT/PTT, fibrinógeno, dímero D, actividad de proteína C, actividad de proteína S, actividad de ATIII, mutación del factor V Leiden, mutación de protrombina G20210A se realizarán en los laboratorios clínicos del Memorial Herman Hospital.

RoTEG

Las muestras de sangre entera se extraerán como se describe anteriormente. Las mediciones se realizarán en dos analizadores de coagulación roTEG de Pentapharm. Los vasos de reacción de plástico RoTEG se adquieren del fabricante. Las pipetas de polipropileno y polietileno se utilizan para manipular reactivos y sangre. La sangre entera citratada se volverá a calcificar con 20 mcl de 0,2 mol/l de CaCl2 y se activará con una solución de 20 mcl de TF humano recombinante (Innovin) diluido 1:1000 con un tampón de barbital sódico. Los parámetros medidos han sido definidos por el fabricante de la siguiente manera: El tiempo de coagulación (CT) es el tiempo en segundos desde que Ca2+ activa la coagulación y hasta que se obtiene un aumento en la elasticidad correspondiente a 2 mm gráficos en ordenadas. El tiempo de formación del coágulo (CFT) es el tiempo en segundos que pasa mientras la elasticidad aumenta de 2 mm a 20 mm en la ordenada. La formación máxima de coágulo (MCF) expresa la fuerza máxima en milímetros del coágulo final. Sorensen et al 28 han definido varios parámetros adicionales que representan el registro continuo de la formación de coágulos: la velocidad máxima (MaxVel) de formación de coágulos, el tiempo hasta la velocidad máxima (T,MaxVel) de formación de coágulos y el área bajo la curva de velocidad (AUC).

Generación de trombina

Las mediciones de generación de trombina automatizadas y calibradas se realizarán utilizando la metodología de Hemker. 29 El plasma rico en plaquetas (PRP) se preparará como se describe anteriormente. El sustrato fluorogénico y la trombina cromogénica se comprarán a través de Thermolabsystems, y el factor tisular relipidado recombinante (TF) a través de Dade Behring. El complejo alfa 2 macroglobulina-trombina utilizado como calibrador se adquirirá a través de Thrombolabsystems. Los trombogramas se medirán en un fluorómetro de placa de 96 pocillos (lector Ascent, Thrombolabsystems) y se analizarán con software adquirido a través de Thrombinoscope. Los experimentos se realizarán por cuadruplicado y se compararán con un calibrador. A cada pozo se agregarán 80 mcl de plasma, seguido del calibrador o tampón, luego el "gatillo": 20 mcl de 3 mM de TF. La placa se colocará en el fluorómetro y se dejará calentar a 37 C. El instrumento dispensa 20 mcl de sustrato fluorogénico 2,5 mM y CaCl2 100 mM (FluCa) a todos los pocillos a medir, registra esto como tiempo cero, los agita durante 10 s y comienza la lectura. Durante la medición, el programa compara las lecturas del TG y el CL, calcula la concentración de trombina y muestra la concentración de trombina en el tiempo. La trombina máxima es la concentración de trombina más alta alcanzada durante el transcurso del tiempo de formación e inhibición de la trombina. El potencial de trombina es la cantidad de trombina que se forma en 60 minutos (Área bajo la curva). La fase de latencia y el tiempo pico se refieren al inicio y la velocidad de formación de trombina, respectivamente.

Gestión de datos Los datos se recopilarán en formularios en papel que serán diseñados por la sección central de informática de GCRC. El núcleo de informática de GCRC mantendrá los datos en una base de datos segura (Access). A cada sujeto se le asignará una identificación única que reflejará el orden en que se realizó la inscripción.

Análisis y presentación de datos

Este es un estudio piloto destinado a proporcionar los datos preliminares para futuros estudios clínicos. Se utilizarán estadísticas descriptivas para caracterizar ETP y roTEG en la presentación inicial de sepsis. Se informarán las medias y los rangos para cada una de las variables en el ensayo de generación de trombina (tiempo de retraso, pendiente de aumento, valor máximo y área bajo la curva) y roTEG (tiempo de formación de coágulos (CFT), formación máxima de coágulos (MCF), velocidad máxima (MaxVel) de formación de coágulos, tiempo hasta la velocidad máxima (T,MaxVel) de formación de coágulos y área bajo la curva de velocidad (AUC)). El objetivo principal de este estudio es comparar la ETP en la presentación con el desarrollo de DIC, según lo definido por una puntuación ISTH DIC positiva. El objetivo secundario será comparar las variables de coagulación del huésped, incluidas ETP, roTEG, Pro C, Pro S, ATIII, FVL y la mutación de protrombina G20210A en el momento de la presentación, con las medidas de resultado secundarias de mortalidad a los 28 días y disfunción orgánica. Todas las estadísticas se realizarán utilizando NCSS/PASS.

Determinación del tamaño de la muestra: No hay informes publicados de ensayos de generación de trombina o tromboelastografía en sepsis o CID. En nuestros estudios previos de pacientes que tomaban un anticoagulante (warfarina), hubo una disminución del 400% de ETP (1719 a 404). Para derivar una ETP media con un ancho objetivo de 100 y un intervalo de confianza del 95 %, suponiendo una desviación estándar de 259, necesitaremos inscribir a 100 pacientes.

Emplearemos los siguientes métodos estadísticos para el análisis de datos:

Objetivo específico #1: El potencial de trombina endógena (ETP) es el área bajo la curva del ensayo de generación de trombina. Los valores son continuos y oscilan entre 0 y 2.500. La formación máxima de coágulos (MCF) del roTEG también se utilizará para aproximar la ETP. La puntuación DIC se calculará y codificará como una variable dicotómica: Sí (puntuación > 5) o No (puntuación < 5). Se derivará una curva operativa del receptor para ETP y MCT y su sensibilidad y especificidad para predecir DIC. Si se determina que el área bajo la curva es significativa, se elegirá un valor de corte óptimo con el mayor grado de precisión. Este valor se utilizará para estimar el valor predictivo de la prueba. El valor predictivo positivo se calculará con la fórmula: # pacientes con ETP o MCT por encima del punto de corte y desarrollo de DIC / # pacientes con puntuación DIC positiva. El valor predictivo de una puntuación DIC negativa se calculará mediante la fórmula: # pacientes con ETP o MCT por debajo del límite y sin progresión a DIC / # pacientes con puntuación DIC negativa.

Objetivo específico n.° 2: se realizará un análisis multivariado para determinar cuáles de las variables predictoras (ETP, MCT, Pro C, Pro S, ATIII, FVL, ProG20210A, DIC) están asociadas con las medidas de resultado dicotómicas secundarias: disfunción orgánica a los 28 días (Cualquiera/Ninguno), mortalidad a los 28 días (Muerto/Vivo).