Thrombingenerering og tromboelastografi i ikke-overt DIC

Aktivering af koagulationssystemet forekommer tidligt hos patienter med sepsis, selvom klinisk åbenlys dissemineret intravaskulær koagulation (DIC) kun identificeres hos et mindretal af patienter med svær sepsis. Ukontrolleret aktivering af koagulationssystemet kan bidrage til patofysiologien af ​​multipel organsvigt og den efterfølgende morbiditet og mortalitet af sepsis. Identifikation af risikofaktorer, der forudsiger progression til svær sepsis og DIC, har været uhåndgribelig. Vi foreslår, at fuldblods- og cellerige koagulationsassays vil tilbyde forbedret følsomhed over for både prokoagulerende og anti-koagulerende ændringer, som forekommer tidligt i sepsis og vil forbedre genkendelsen af ​​ikke-åbent DIC. Fremtidige undersøgelser vil tage fat på, om disse assays har tilstrækkelig høj prædiktiv værdi til at identificere undergrupper af patienter, som kunne drage fordel af tidlig intervention.

Specifikke mål:

1. Vi antager, at øget thrombingenerering vil gå forud for udviklingen af ​​åbenlys DIC i en klinisk signifikant tidsperiode. Vores primære mål er at bestemme, om endogent trombinpotentiale målt ved den første diagnose af sepsis forud for indtræden af ​​DIC og organsvigt er prædiktiv for åbenlys DIC.
2. Der er betydelig individuel variation blandt den raske befolkning i endogen thrombingenerering på grund af kendte og ukendte polymorfismer i koagulationsproteiner. Vi forudsiger, at værtsvariabler i thrombingenerering vil bidrage til modtagelighed for DIC og dårligt resultat under sepsis. Et sekundært formål med denne undersøgelse er at bestemme, om værtens koagulationsvariabler disponerer for morbiditet og dødelighed forbundet med sepsis.

Eksperimentelt design og metoder

Undersøgelsesdesignet vil være et prospektivt observationsstudie af patienter, der præsenterer sig på Memorial Hermann Hospitals akutafdeling med sepsis. Kriterier for sepsis omfatter tegn på systemisk inflammatorisk respons-syndrom som defineret af ACCP/SCCM Consensus Conference og en kendt eller mistænkt infektion. Eksklusionskriterier omfatter tegn på svær sepsis eller septisk shock, som defineret af ACCP/SCCM Consensus Conference, ved præsentationen, herunder: organdysfunktion, hypoperfusion og perfusionsabnormiteter. Kroniske medicinske tilstande forbundet med immunsuppression eller koagulopatier, såsom neutropeni og seglcellesygdom, og brug af medicin, der fører til immundysfunktion eller koagulopatier, såsom kronisk steroidbrug eller anti-koagulation, vil også være årsager til udelukkelse. På grund af den mængde blod, der kræves fra hver patient til laboratorieundersøgelser, vil kun patienter på 25 kg kropsvægt eller mere blive indskrevet. Udmeldelse fra undersøgelsen vil ske efter den behandlende læges eller forsøgspersonens skøn. Der vil blive gjort alt for at indsamle klinisk information fra patienter, der har trukket sig.

Inklusionskriterier

• Kendt eller formodet infektion som bestemt af den behandlende læge Patient, der skal indlægges på hospitalet
• Systemisk inflammatorisk responssyndrom: 3 af følgende 4 kriterier:
• Temperatur > 38 C eller < 35 C
• Hjertefrekvens > 90 slag/min, undtagen hos patienter med en medicinsk tilstand, der vides at øge hjertefrekvensen, eller dem, der modtager behandling, der ville forhindre takykardi.
• Respirationsfrekvens > 20 vejrtrækninger/min eller PaC02 < 32 mmHg, eller ved mekanisk ventilation ved akut respirationsproces.
• Antal hvide blodlegemer > 12.000/mm3, < 4.000/mm3 eller > 10 % bånd

Eksklusionskriterier

• - Brug af følgende lægemidler: ufraktioneret heparin til behandling af en aktiv trombotisk hændelse inden for 8 timer før infusionen; lavmolekylært heparin i en højere dosis end anbefalet til profylaktisk brug inden for 12 timer før infusionen, warfarin brugt inden for 7 dage efter undersøgelsens start, aspirinbrug i en dosis på mere end 650 mg/dag inden for 3 dage før undersøgelsen, trombolytisk behandling inden for 3 dage før undersøgelsen, glycoprotein IIb/IIIa-antagonister inden for 7 dage før undersøgelsens start, administration af aktiveret protein C (Xigris ) i 24 timer før undersøgelsens start.
• Neutropeni
• Hæmofili
• Diabetisk ketoacidose
• Vægt < 25 kg

Patienter vil blive indskrevet på skadestuen inden for 2 timer efter opfyldelse af berettigelse. Der vil blive indhentet skriftligt informeret samtykke fra patienterne eller deres autoriserede repræsentanter. Blodprøver vil blive udtaget ved perifer venepunktur i løbet af den første time efter indskrivning og derefter en gang dagligt i 7 dage (se bilag A).

Patienter vil blive trukket tilbage fra undersøgelsen, hvis blodprøvetagning ikke udføres inden for 2 timer efter opnåelse af informeret samtykke.

Klinisk dataindsamling Kliniske dataskemaer (se appendiks B) udfyldes ved indskrivning og dagligt i 7 dage, ved hospitalsudskrivning og efter 28 dage. Klinikere vil blive blindet over for resultaterne af forskningslaboratorietestene.

Laboratoriemetoder

Blod og plasma Hver patient vil have 15 ml blod opsamlet ved indskrivning. Prøver vil blive taget gennem antecubital venepunktur. Frit flow eller minimal sugning vil blive anvendt; vakuumbeholdere vil blive undgået. Prøver til blodpladefattigt plasma (PPP) og fuldblodsanalyse vil blive opsamlet i silikoniserede glasrør med 0,105 M tri-natriumcitrat i forholdet 1 del antikoagulant til 9 dele fuldblod. PPP vil blive adskilt inden for 60 minutter og analyseret med det samme. Blodpladerige plasma (PRP)-prøver vil blive adskilt fra det øverste ¾ volumen af ​​plasmasupernatant efter centrifugering ved 265 g i 10 minutter ved stuetemperatur. Blodpladerne tælles på en Beckman Coulter-tæller og justeres til 150 X 109 blodplader/l med autolog PPP. PRP vil blive brugt inden for 60 minutter. Cbc, PT/PTT, Fibrinogen, d-dimer, Protein C aktivitet, Protein S aktivitet, ATIII aktivitet, Faktor V Leiden mutation, Prothrombin G20210A mutationsanalyse vil blive udført i Memorial Herman Hospitals kliniske laboratorier.

RoTEG

Fuldblodsprøver vil blive udtaget som beskrevet ovenfor. Målinger vil blive udført på to roTEG koagulationsanalysatorer fra Pentapharm. RoTEG reaktionskopper i hel plast er indkøbt fra producenten. Polypropylen- og polyethylenpipetter bruges til at håndtere reagenser og blod. Citreret fuldblod vil blive genforkalket med 20 mcl 0,2 mol/L CaCl2 og aktiveret med 20 mcl opløsning af rekombinant human TF (Innovin) fortyndet 1:1000 under anvendelse af en natriumbarbitalbuffer. De målte parametre er defineret af producenten som følger: Koagulationstiden (CT) er tiden i sekunder fra Ca2+ aktivering af koagulation og indtil en forøgelse af elasticiteten svarende til 2 grafiske mm opnås på ordinaten. Koagulationstiden (CFT) er tiden i sekunder, der går, mens elasticiteten øges fra 2 mm til 20 mm på ordinaten. Den maksimale koageldannelse (MCF) udtrykker den maksimale styrke i millimeter af den endelige koagel. Adskillige yderligere parametre, der repræsenterer den kontinuerlige registrering af koageldannelse, er blevet defineret af Sorensen et al 28: den maksimale hastighed (MaxVel) for koageldannelse, tiden til maksimal hastighed (T,MaxVel) for koageldannelse og arealet under hastighedskurven (AUC).

Thrombin generation

Kalibrerede automatiserede thrombingenereringsmålinger vil blive udført ved hjælp af Hemker-metoden. 29 Blodpladerigt plasma (PRP) vil blive fremstillet som beskrevet ovenfor. Fluorogent substrat og kromogent thrombin vil blive købt gennem Thermolabsystems og rekombinant relipidated tissue factor (TF) gennem Dade Behring. alfa 2-makroglobulin-thrombin-kompleks brugt som kalibrator vil blive købt gennem Thrombolabsystems. Trombogrammerne vil blive målt i et 96-brønds pladefluorometer (Ascent reader, Thrombolabsystems) og analyseret med software købt gennem Thrombinoscope. Eksperimenter vil blive udført i fire eksemplarer og sammenlignet med en kalibrator. Til hver brønd sættes 80 mcl plasma efterfulgt af kalibratoren eller bufferen, derefter "triggeren": 20 mcl af 3 mM TF. Pladen placeres i fluorometeret og får lov at varme op til 37 C. Instrumentet dispenserer 20 mcl fluorogent substrat 2,5 mM og CaCl2 100 mM (FluCa) til alle brøndene, der skal måles, registrerer dette som nultid, ryster dem i 10 s og begynder at læse. Under målingen sammenligner programmet aflæsningerne fra TG og CL, beregner trombinkoncentrationen og viser trombinkoncentrationen i tid. Det maksimale thrombin er den højeste thrombinkoncentration, der opnås i løbet af tidsforløbet for thrombindannelse og -hæmning. Thrombinpotentialet er mængden af ​​thrombin, der dannes inden for 60 minutter (areal under kurven). Lagfasen og spidsbelastningstiden refererer til henholdsvis starten og hastigheden af ​​thrombindannelse.

Datastyring Data vil blive indsamlet på papirformularer, som vil blive designet af GCRC-informatikkernesektionen. GCRC-informatikkernen vil vedligeholde data på en sikker database (Access). Hvert emne vil blive tildelt et unikt ID, der afspejler den rækkefølge, som tilmeldingen fandt sted.

Dataanalyse og præsentation

Dette er et pilotstudie, der skal give de foreløbige data til fremtidige kliniske undersøgelser. Beskrivende statistik vil blive brugt til at karakterisere ETP og roTEG ved indledende præsentation af sepsis. Middelværdier og intervaller vil blive rapporteret for hver af variablerne i thrombingenereringsassayet (forsinkelsestid, stigningshældning, topværdi og areal under kurven) og roTEG (koageldannelsestid (CFT), maksimal koageldannelse (MCF), maksimal hastighed (MaxVel) for koageldannelse, tid til maksimal hastighed (T,MaxVel) for koageldannelse og areal under hastighedskurven (AUC)). Det primære formål med denne undersøgelse er at sammenligne ETP ved præsentationen med udviklingen af ​​DIC, som defineret ved en positiv ISTH DIC-score. Det sekundære mål vil være at sammenligne værtens koagulationsvariabler, herunder ETP, roTEG, Pro C, Pro S, ATIII, FVL og prothrombin G20210A mutation ved præsentationen, med de sekundære udfaldsmål for 28-dages dødelighed og organdysfunktion. Al statistik vil blive udført ved hjælp af NCSS/PASS.

Bestemmelse af prøvestørrelse: Der er ingen publicerede rapporter om thrombingenereringsassays eller tromboelastografi i sepsis eller DIC. I vores tidligere undersøgelser af patienter, der tog et antikoagulant (warfarin), var der en 400 % reduktion af ETP (1719 til 404). For at udlede en gennemsnitlig ETP med en målbredde på 100 og 95 % konfidensinterval, forudsat en standardafvigelse på 259, bliver vi nødt til at indskrive 100 patienter.

Vi vil anvende følgende statistiske metoder til analyse af data:

Specifikt mål #1: Det endogene thrombinpotentiale (ETP) er arealet under kurven for thrombingenereringsassayet. Værdierne er kontinuerlige og går fra 0 til 2.500. Maksimal koageldannelse (MCF) fra roTEG vil også blive brugt til at tilnærme ETP. DIC-scoren vil blive beregnet og kodet som en dikotom variabel: Ja (score > 5) eller Nej (score < 5). En modtagerdriftskurve vil blive udledt for ETP og MCT og dens sensitivitet og specificitet til at forudsige DIC. Hvis arealet under kurven viser sig at være signifikant, vil der blive valgt en optimal afskæringsværdi med den højeste grad af nøjagtighed. Denne værdi vil blive brugt til at estimere den prædiktive værdi af testen. Positiv prædiktiv værdi vil blive beregnet med formlen: # patienter med ETP eller MCT over cut-off og udvikling af DIC / # patienter med positiv DIC score. Den prædiktive værdi af en negativ DIC-score vil blive beregnet ved hjælp af formlen: # patienter med ETP eller MCT under cut-off og ingen progression til DIC / # patienter med negativ DIC-score.

Specifikt mål #2: En multivariat analyse vil blive udført for at bestemme, hvilke af prædiktorvariablerne (ETP, MCT, Pro C, Pro S, ATIII, FVL, ProG20210A, DIC) der er forbundet med de sekundære dikotome udfaldsmål: organdysfunktion ved 28. dage (Alle/Ingen), 28-dages dødelighed (døde/levende).