Thrombinerzeugung und Thrombelastographie bei nicht offenkundiger DIC

Die Aktivierung des Gerinnungssystems erfolgt früh bei Patienten mit Sepsis, obwohl eine klinisch offenkundige disseminierte intravaskuläre Gerinnung (DIC) nur bei einer Minderheit von Patienten mit schwerer Sepsis festgestellt wird. Eine unkontrollierte Aktivierung des Gerinnungssystems kann zur Pathophysiologie von multiplem Organversagen und der anschließenden Morbidität und Mortalität einer Sepsis beitragen. Die Identifizierung von Risikofaktoren, die eine Progression zu schwerer Sepsis und DIC vorhersagen, war schwer fassbar. Wir schlagen vor, dass Vollblut- und zellreiche Gerinnungsassays eine verbesserte Sensitivität sowohl für prokoagulatorische als auch für gerinnungshemmende Veränderungen bieten, die früh in der Sepsis auftreten, und die Erkennung von nicht offenkundiger DIC verbessern. Zukünftige Studien werden untersuchen, ob diese Assays einen ausreichend hohen Vorhersagewert haben, um Untergruppen von Patienten zu identifizieren, die von einer frühen Intervention profitieren könnten.

Spezifische Ziele:

1. Wir nehmen an, dass eine erhöhte Thrombinbildung der Entwicklung einer manifesten DIC um einen klinisch signifikanten Zeitraum vorausgeht. Unser primäres Ziel ist es zu bestimmen, ob das endogene Thrombinpotential, das bei der ersten Diagnose einer Sepsis vor dem Einsetzen von DIC und Organversagen gemessen wird, ein Anzeichen für eine manifeste DIC ist.
2. Aufgrund bekannter und unbekannter Polymorphismen innerhalb von Gerinnungsproteinen gibt es bei der gesunden Bevölkerung erhebliche individuelle Unterschiede bei der endogenen Thrombinerzeugung. Wir sagen voraus, dass Wirtsvariablen bei der Thrombinerzeugung zur Anfälligkeit für DIC und zu einem schlechten Ergebnis während einer Sepsis beitragen werden. Ein sekundäres Ziel dieser Studie ist die Bestimmung, ob Gerinnungsvariablen des Wirts für die mit Sepsis verbundene Morbidität und Mortalität prädisponieren.

Experimentelles Design und Methoden

Das Studiendesign wird eine prospektive Beobachtungsstudie von Patienten sein, die sich mit Sepsis in der Notaufnahme des Memorial Hermann Hospital vorstellen. Kriterien für eine Sepsis umfassen den Nachweis eines systemischen Entzündungsreaktionssyndroms gemäß der Definition der ACCP/SCCM-Konsensuskonferenz und eine bekannte oder vermutete Infektion. Zu den Ausschlusskriterien gehören Anzeichen einer schweren Sepsis oder eines septischen Schocks, wie von der ACCP/SCCM-Konsensuskonferenz definiert, bei der Präsentation, einschließlich: Organdysfunktion, Hypoperfusion und Perfusionsanomalien. Chronische Erkrankungen im Zusammenhang mit Immunsuppression oder Koagulopathien, wie Neutropenie und Sichelzellenanämie, und die Einnahme von Medikamenten, die zu Immunstörungen oder Koagulopathien führen, wie chronische Steroidanwendung oder Antikoagulation, sind ebenfalls Gründe für den Ausschluss. Darüber hinaus werden aufgrund des Blutvolumens, das von jedem Patienten für Laborstudien benötigt wird, nur Patienten mit einem Körpergewicht von 25 kg oder mehr aufgenommen. Der Ausstieg aus der Studie liegt im Ermessen des behandelnden Arztes oder Probanden. Es werden alle Anstrengungen unternommen, um klinische Informationen von Patienten zu sammeln, die sich zurückgezogen haben.

Einschlusskriterien

• Bekannte oder vermutete Infektion, wie vom behandelnden Arzt festgestellt Patient, der ins Krankenhaus eingeliefert werden soll
• Systemisches Entzündungsreaktionssyndrom: 3 der folgenden 4 Kriterien:
• Temperatur > 38 C oder < 35 C
• Herzfrequenz > 90 Schläge/min, außer bei Patienten mit Erkrankungen, von denen bekannt ist, dass sie die Herzfrequenz erhöhen, oder bei Patienten, die eine Behandlung erhalten, die eine Tachykardie verhindern würde.
• Atemfrequenz > 20 Atemzüge/min oder PaC02 < 32 mmHg oder bei einem akuten Atmungsprozess auf mechanische Beatmung.
• Leukozytenzahl > 12.000/mm3, < 4.000/mm3 oder > 10 % Banden

Ausschlusskriterien

• - Verwendung der folgenden Medikamente: unfraktioniertes Heparin zur Behandlung eines aktiven thrombotischen Ereignisses innerhalb von 8 Stunden vor der Infusion; Heparin mit niedrigem Molekulargewicht in einer höheren Dosis als empfohlen zur prophylaktischen Anwendung innerhalb von 12 Stunden vor der Infusion, Anwendung von Warfarin innerhalb von 7 Tagen nach Studieneintritt, Anwendung von Aspirin in einer Dosis von mehr als 650 mg/Tag innerhalb von 3 Tagen vor der Studie, Thrombolytische Therapie innerhalb von 3 Tagen vor Studienbeginn, Glykoprotein-IIb/IIIa-Antagonisten innerhalb von 7 Tagen vor Studieneintritt, Gabe von aktiviertem Protein C (Xigris) in den 24 Stunden vor Studieneintritt.
• Neutropenie
• Hämophilie
• Diabetische Ketoazidose
• Gewicht < 25 kg

Die Patienten werden innerhalb von 2 Stunden nach Eintritt in die Notaufnahme aufgenommen. Die schriftliche Einverständniserklärung wird von den Patienten oder ihren autorisierten Vertretern eingeholt. Blutproben werden durch periphere Venenpunktion während der ersten Stunde nach der Einschreibung und dann einmal täglich für 7 Tage entnommen (siehe Anhang A).

Patienten werden aus der Studie genommen, wenn die Blutentnahme nicht innerhalb von 2 Stunden nach Erhalt der Einverständniserklärung durchgeführt wird.

Klinische Datenerhebung Klinische Datenformulare (siehe Anhang B) werden zum Zeitpunkt der Einschreibung und täglich für 7 Tage, bei der Entlassung aus dem Krankenhaus und nach 28 Tagen ausgefüllt. Kliniker werden gegenüber den Ergebnissen der Forschungslabortests blind sein.

Labormethoden

Blut und Plasma Jedem Patienten werden bei der Aufnahme 15 ml Blut entnommen. Die Proben werden durch antekubitale Venenpunktion gewonnen. Freier Fluss oder minimale Saugkraft werden verwendet; Vakuumbehälter werden vermieden. Proben für plättchenarmes Plasma (PPP) und Vollblutanalysen werden in silikonisierten Glasröhrchen mit 0,105 M Trinatriumcitrat im Verhältnis von 1 Teil Antikoagulans zu 9 Teilen Vollblut gesammelt. PSM werden innerhalb von 60 Minuten abgetrennt und sofort analysiert. Plättchenreiches Plasma (PRP)-Proben werden nach 10-minütiger Zentrifugation bei 265 g bei Raumtemperatur vom oberen ¾ Volumen des Plasmaüberstands getrennt. Die Blutplättchen werden auf einem Beckman Coulter-Zähler gezählt und mit autologem PPP auf 150 x 10&sup9; Blutplättchen/l eingestellt. PRP wird innerhalb von 60 Minuten verwendet. Cbc, PT/PTT, Fibrinogen, d-Dimer, Protein-C-Aktivität, Protein-S-Aktivität, ATIII-Aktivität, Faktor-V-Leiden-Mutation, Prothrombin-G20210A-Mutationsanalyse werden in den klinischen Labors des Memorial Herman Hospital durchgeführt.

RoTEG

Vollblutproben werden wie oben beschrieben entnommen. Die Messungen werden auf zwei roTEG Coagulation Analyzern von Pentapharm durchgeführt. RoTEG-Vollkunststoff-Reaktionsbecher werden vom Hersteller bezogen. Zur Handhabung von Reagenzien und Blut werden Pipetten aus Polypropylen und Polyethylen verwendet. Citrat-Vollblut wird mit 20 mcl 0,2 mol/l CaCl2 rekalzifiziert und mit 20 mcl Lösung von rekombinantem humanem TF (Innovin), verdünnt 1:1000 unter Verwendung eines Natriumbarbitalpuffers, aktiviert. Die gemessenen Parameter wurden vom Hersteller wie folgt definiert: Die Gerinnungszeit (CT) ist die Zeit in Sekunden von der Ca2+-Aktivierung der Gerinnung bis zum Erhalt einer Elastizitätszunahme, die graphisch 2 mm auf der Ordinate entspricht. Die Gerinnselbildungszeit (CFT) ist die Zeit in Sekunden, die vergeht, während die Elastizität von 2 mm auf 20 mm auf der Ordinate zunimmt. Die maximale Gerinnselbildung (MCF) drückt die maximale Stärke des endgültigen Gerinnsels in Millimetern aus. Mehrere zusätzliche Parameter, die die kontinuierliche Registrierung der Gerinnselbildung darstellen, wurden von Sorensen et al. definiert 28: die maximale Geschwindigkeit (MaxVel) der Gerinnselbildung, die Zeit bis zur maximalen Geschwindigkeit (T,MaxVel) der Gerinnselbildung und die Fläche unter der Geschwindigkeitskurve (AUC).

Thrombin-Erzeugung

Kalibrierte automatisierte Thrombinerzeugungsmessungen werden unter Verwendung der Hemker-Methodik durchgeführt. 29 Blutplättchenreiches Plasma (PRP) wird wie oben beschrieben hergestellt. Fluorogenes Substrat und chromogenes Thrombin werden von Thermolabsystems und rekombinanter relipidierter Gewebefaktor (TF) von Dade Behring bezogen. Alpha-2-Makroglobulin-Thrombin-Komplex, der als Kalibrator verwendet wird, wird von Thrombolabsystems bezogen. Die Thrombogramme werden in einem Platten-Fluorometer mit 96 Vertiefungen (Ascent Reader, Thrombolabsystems) gemessen und mit Software analysiert, die über Thrombinoscope erworben wurde. Die Versuche werden vierfach durchgeführt und mit einem Kalibrator verglichen. In jede Vertiefung werden 80 µl Plasma gegeben, gefolgt vom Kalibrator oder Puffer, dann der "Trigger": 20 µl 3 mM TF. Die Platte wird in das Fluorometer gestellt und auf 37 C erwärmen gelassen. Das Instrument gibt 20 mcl fluorogenes Substrat 2,5 mM und CaCl2 100 mM (FluCa) in alle zu messenden Vertiefungen ab, registriert dies als Nullzeit, schüttelt sie 10 s lang und beginnt mit der Messung. Während der Messung vergleicht das Programm die Messwerte von TG und CL, berechnet die Thrombinkonzentration und zeigt die Thrombinkonzentration im Zeitverlauf an. Die Spitzenthrombinkonzentration ist die höchste Thrombinkonzentration, die während des Zeitverlaufs der Thrombinbildung und -hemmung erreicht wird. Das Thrombinpotential ist die Menge an Thrombin, die innerhalb von 60 Minuten gebildet wird (Fläche unter der Kurve). Die Lag-Phase und die Peak-Zeit beziehen sich auf den Beginn bzw. die Geschwindigkeit der Thrombinbildung.

Datenmanagement Daten werden auf Papierformularen gesammelt, die von der Kernsektion Informatik des GCRC entworfen werden. Der GCRC-Informatikkern wird Daten in einer sicheren Datenbank (Access) verwalten. Jedem Probanden wird eine eindeutige ID zugewiesen, die die Reihenfolge widerspiegelt, in der die Einschreibung stattgefunden hat.

Datenanalyse und Präsentation

Dies ist eine Pilotstudie, die die vorläufigen Daten für zukünftige klinische Studien liefern soll. Beschreibende Statistiken werden verwendet, um ETP und roTEG beim erstmaligen Auftreten einer Sepsis zu charakterisieren. Mittelwerte und Bereiche werden für jede der Variablen im Thrombinbildungsassay (Verzögerungszeit, Anstiegssteigung, Spitzenwert und Fläche unter der Kurve) und roTEG (Gerinnselbildungszeit (CFT), maximale Gerinnselbildung (MCF), maximale Geschwindigkeit (MaxVel) der Gerinnselbildung, Zeit bis zur maximalen Geschwindigkeit (T, MaxVel) der Gerinnselbildung und Fläche unter der Geschwindigkeitskurve (AUC)). Das primäre Ziel dieser Studie ist der Vergleich von ETP bei Vorstellung mit der Entwicklung von DIC, definiert durch einen positiven ISTH-DIC-Score. Das sekundäre Ziel besteht darin, die Gerinnungsvariablen des Wirts, einschließlich ETP, roTEG, Pro C, Pro S, ATIII, FVL und Prothrombin G20210A-Mutation bei der Präsentation, mit den sekundären Ergebnismessungen der 28-Tage-Mortalität und Organfunktionsstörung zu vergleichen. Alle Statistiken werden mit NCSS/PASS durchgeführt.

Bestimmung der Probengröße: Es gibt keine veröffentlichten Berichte über Assays zur Thrombinerzeugung oder Thromboelastographie bei Sepsis oder DIC. In unseren früheren Studien mit Patienten, die ein Antikoagulans (Warfarin) einnahmen, gab es eine 400%ige Abnahme von ETP (1719 bis 404). Um einen mittleren ETP mit einer Zielbreite von 100 und einem Konfidenzintervall von 95 % abzuleiten, müssen wir unter der Annahme einer Standardabweichung von 259 100 Patienten aufnehmen.

Für die Datenanalyse setzen wir folgende statistische Verfahren ein:

Spezifisches Ziel Nr. 1: Das endogene Thrombinpotential (ETP) ist die Fläche unter der Kurve des Thrombinerzeugungsassays. Die Werte sind kontinuierlich und reichen von 0 bis 2.500. Die maximale Gerinnselbildung (MCF) aus dem roTEG wird auch verwendet, um ETP zu approximieren. Der DIC-Score wird berechnet und als dichotome Variable kodiert: Ja (Score > 5) oder Nein (Score < 5). Eine Empfängerbetriebskurve wird für ETP und MCT und ihre Empfindlichkeit und Spezifität für die Vorhersage von DIC abgeleitet. Wenn sich herausstellt, dass die Fläche unter der Kurve signifikant ist, wird ein optimaler Cut-off-Wert mit der höchsten Genauigkeit gewählt. Dieser Wert wird verwendet, um den Vorhersagewert des Tests zu schätzen. Der positive prädiktive Wert wird mit folgender Formel berechnet: # Patienten mit ETP oder MCT über dem Grenzwert und Entwicklung von DIC / # Patienten mit positivem DIC-Score. Der prädiktive Wert eines negativen DIC-Scores wird anhand der Formel berechnet: # Patienten mit ETP oder MCT unterhalb des Grenzwerts und ohne Progression zu DIC / # Patienten mit negativem DIC-Score.

Spezifisches Ziel Nr. 2: Es wird eine multivariate Analyse durchgeführt, um zu bestimmen, welche der Prädiktorvariablen (ETP, MCT, Pro C, Pro S, ATIII, FVL, ProG20210A, DIC) mit den sekundären dichotomen Ergebnismaßen assoziiert sind: Organdysfunktion bei 28 Tage (beliebig/keine), 28-Tage-Sterblichkeit (tot/lebendig).