Generowanie trombiny i tromboelastografia w niejawnym DIC

Aktywacja układu krzepnięcia następuje wcześnie u pacjentów z sepsą, chociaż klinicznie jawne rozsiane wykrzepianie wewnątrznaczyniowe (DIC) stwierdza się tylko u mniejszości pacjentów z ciężką sepsą. Niekontrolowana aktywacja układu krzepnięcia może przyczynić się do patofizjologii niewydolności wielonarządowej i późniejszej zachorowalności i śmiertelności z powodu sepsy. Identyfikacja czynników ryzyka przewidujących progresję do ciężkiej sepsy i DIC była nieuchwytna. Sugerujemy, że testy krzepnięcia krwi pełnej i krwi bogatej w komórki zapewnią lepszą czułość zarówno na zmiany prokoagulacyjne, jak i antykoagulacyjne, które pojawiają się we wczesnej fazie sepsy i poprawią rozpoznawanie niejawnego DIC. Przyszłe badania będą dotyczyć tego, czy te testy mają wystarczająco wysoką wartość predykcyjną, aby zidentyfikować podgrupy pacjentów, którzy mogliby odnieść korzyści z wczesnej interwencji.

Cele szczegółowe:

1. Stawiamy hipotezę, że zwiększone wytwarzanie trombiny poprzedzi rozwój jawnego DIC o klinicznie istotny okres czasu. Naszym głównym celem jest ustalenie, czy endogenny potencjał trombiny mierzony przy pierwszym rozpoznaniu posocznicy przed wystąpieniem DIC i niewydolnością narządową jest predyktorem jawnej DIC.
2. Istnieje znaczna indywidualna zmienność wśród zdrowej populacji w wytwarzaniu endogennej trombiny z powodu znanych i nieznanych polimorfizmów w obrębie białek krzepnięcia. Przewidujemy, że zmienne gospodarza w wytwarzaniu trombiny przyczynią się do podatności na DIC i złego wyniku podczas sepsy. Drugorzędnym celem tego badania jest ustalenie, czy zmienne krzepnięcia żywiciela predysponują do zachorowalności i śmiertelności związanej z sepsą.

Projekt eksperymentalny i metody

Projekt badania będzie prospektywnym badaniem obserwacyjnym pacjentów zgłaszających się na oddział ratunkowy szpitala Memorial Hermann z posocznicą. Kryteria sepsy obejmują objawy zespołu ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej, zgodnie z definicją uzgodnioną na konferencji ACCP/SCCM, oraz znane lub podejrzewane zakażenie. Kryteria wykluczenia obejmują objawy ciężkiej posocznicy lub wstrząsu septycznego, zgodnie z definicją uzgodnioną na konferencji ACCP/SCCM, w momencie zgłoszenia, w tym: dysfunkcja narządów, hipoperfuzja i nieprawidłowości perfuzji. Przewlekłe schorzenia związane z immunosupresją lub koagulopatiami, takie jak neutropenia i niedokrwistość sierpowatokrwinkowa oraz stosowanie leków prowadzących do dysfunkcji układu odpornościowego lub koagulopatii, takich jak przewlekłe stosowanie sterydów lub antykoagulacji, również będą powodem wykluczenia. Ponadto, ze względu na objętość krwi wymaganą od każdego pacjenta do badań laboratoryjnych, włączeni zostaną tylko pacjenci o masie ciała 25 kg lub większej. Wycofanie się z badania będzie zależało od uznania lekarza prowadzącego lub uczestnika. Dołożymy wszelkich starań, aby zebrać informacje kliniczne od pacjentów, którzy się wycofali.

Kryteria przyjęcia

• Znana lub podejrzewana infekcja w ocenie lekarza prowadzącego Pacjent do przyjęcia do szpitala
• Zespół ogólnoustrojowej reakcji zapalnej: 3 z następujących 4 kryteriów:
• Temperatura > 38 C lub < 35 C
• Tętno > 90 uderzeń/min, z wyjątkiem pacjentów ze schorzeniami, o których wiadomo, że zwiększają częstość akcji serca lub otrzymujących leczenie zapobiegające tachykardii.
• Częstość oddechów > 20 oddechów/min lub PaC02 < 32 mmHg lub wentylacja mechaniczna w przypadku ostrego procesu oddechowego.
• Liczba białych krwinek > 12 000/mm3, < 4 000/mm3 lub > 10% prążków

Kryteria wyłączenia

• - Stosowanie następujących leków: heparyna niefrakcjonowana w leczeniu czynnego zdarzenia zakrzepowego w ciągu 8 godzin przed infuzją; heparyna drobnocząsteczkowa w dawce większej niż zalecana do stosowania profilaktycznego w ciągu 12 godzin przed wlewem, warfaryna zastosowana w ciągu 7 dni od włączenia do badania, zastosowanie aspiryny w dawce większej niż 650 mg/dobę w ciągu 3 dni przed badaniem, leczenie trombolityczne w ciągu 3 dni przed badaniem, antagoniści glikoprotein IIb/IIIa w ciągu 7 dni przed włączeniem do badania, podanie aktywowanego białka C (Xigris ) w ciągu 24 godzin przed włączeniem do badania.
• Neutropenia
• Hemofilia
• Cukrzycowa kwasica ketonowa
• Waga < 25 kg

Pacjenci zostaną zapisani na oddział ratunkowy w ciągu 2 godzin od zakwalifikowania się na spotkanie. Pisemna świadoma zgoda zostanie uzyskana od pacjentów lub ich upoważnionych przedstawicieli. Próbki krwi będą pobierane przez nakłucie żyły obwodowej w ciągu pierwszej godziny po przyjęciu, a następnie raz dziennie przez 7 dni (patrz Załącznik A).

Pacjenci zostaną wycofani z badania, jeśli w ciągu 2 godzin od uzyskania świadomej zgody nie zostanie pobrane próbki krwi.

Zbieranie danych klinicznych Formularze danych klinicznych (patrz Załącznik B) będą wypełniane w momencie rejestracji i codziennie przez 7 dni, przy wypisie ze szpitala i po 28 dniach. Klinicyści będą ślepi na wyniki badań laboratoryjnych.

Metody laboratoryjne

Krew i osocze Każdy pacjent otrzyma 15 ml krwi podczas rejestracji. Próbki będą pobierane przez nakłucie żyły łokciowej. Zastosowany zostanie swobodny przepływ lub minimalne ssanie; unika się pojemników próżniowych. Próbki do analizy osocza ubogiego w płytki krwi (PPP) i pełnej krwi zostaną pobrane do silikonowanych szklanych probówek z 0,105 M cytrynianem trisodowym w stosunku 1 część antykoagulantu do 9 części pełnej krwi. PPP zostanie oddzielony w ciągu 60 minut i natychmiast poddany analizie. Próbki osocza bogatopłytkowego (PRP) zostaną oddzielone od górnej ¾ objętości supernatantu osocza po odwirowaniu przy 265 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Płytki będą zliczane na liczniku Beckman Coulter i dostosowywane do 150 X 109 płytek/l za pomocą autologicznego PPP. PRP zostanie użyte w ciągu 60 minut. Analiza Cbc, PT/PTT, fibrynogenu, d-dimeru, aktywności białka C, aktywności białka S, aktywności ATIII, mutacji czynnika V Leiden, mutacji protrombiny G20210A zostanie przeprowadzona w laboratoriach klinicznych Memorial Herman Hospital.

RoTEG

Próbki krwi pełnej zostaną pobrane w sposób opisany powyżej. Pomiary będą wykonywane na dwóch analizatorach krzepnięcia roTEG firmy Pentapharm. Całkowicie plastikowe kubki reakcyjne RoTEG są nabywane od producenta. Pipety polipropylenowe i polietylenowe służą do przenoszenia odczynników i krwi. Cytrynianowa krew pełna zostanie ponownie uwapniona przez 20 mcl 0,2 mol/l CaCl2 i aktywowana przez 20 mcl roztworu rekombinowanego ludzkiego TF (Innovin) rozcieńczonego 1:1000 przy użyciu buforu sodowo-barbitalowego. Mierzone parametry zostały określone przez producenta w następujący sposób: Czas krzepnięcia (CT) to czas w sekundach od aktywacji krzepnięcia Ca2+ do uzyskania przyrostu sprężystości odpowiadającego 2 mm graficznej na rzędnej. Czas tworzenia skrzepu (CFT) to czas w sekundach, który upływa, gdy elastyczność wzrasta od 2 mm do 20 mm na rzędnej. Maksymalne tworzenie skrzepu (MCF) wyraża maksymalną wytrzymałość ostatecznego skrzepu w milimetrach. Kilka dodatkowych parametrów reprezentujących ciągłą rejestrację tworzenia się skrzepu zostało zdefiniowanych przez Sorensena i wsp. 28: maksymalna prędkość (MaxVel) tworzenia się skrzepu, czas do osiągnięcia maksymalnej prędkości (T,MaxVel) tworzenia się skrzepu oraz pole pod krzywą prędkości (AUC).

Pokolenie trombiny

Skalibrowane automatyczne pomiary generacji trombiny zostaną przeprowadzone przy użyciu metodologii Hemkera. 29 Osocze bogatopłytkowe (PRP) zostanie przygotowane w sposób opisany powyżej. Substrat fluorogenny i chromogenna trombina zostaną zakupione przez Thermolabsystems, a rekombinowany relipidowany czynnik tkankowy (TF) przez Dade Behring. kompleks makroglobulina-trombina alfa 2 stosowany jako kalibrator zostanie zakupiony za pośrednictwem firmy Thrombolabsystems. Trombogramy będą mierzone w 96-dołkowym fluorometrze do płytek (czytnik Ascent, Thrombolabsystems) i analizowane za pomocą oprogramowania zakupionego za pośrednictwem Thrombinoscope. Eksperymenty zostaną przeprowadzone w czterech powtórzeniach i porównane z kalibratorem. Do każdej studzienki zostanie dodane 80 µl osocza, następnie kalibrator lub bufor, a następnie „wyzwalacz”: 20 µl 3 mM TF. Płytkę umieszcza się we fluorometrze i pozostawia do ogrzania do 37°C. Przyrząd dozuje 20 µl substratu fluorogennego 2,5 mM i CaCl2 100 mM (FluCa) do wszystkich studzienek, które mają być mierzone, rejestruje to jako czas zerowy, potrząsa nimi przez 10 s i rozpoczyna odczyt. Podczas pomiaru program porównuje odczyty z TG i CL, oblicza stężenie trombiny i wyświetla stężenie trombiny w czasie. Szczytowe stężenie trombiny to najwyższe stężenie trombiny osiągnięte w czasie tworzenia i hamowania trombiny. Potencjał trombiny to ilość trombiny, która powstaje w ciągu 60 minut (pole pod krzywą). Faza opóźnienia i czas szczytu odnoszą się odpowiednio do początku i szybkości tworzenia trombiny.

Zarządzanie danymi Dane będą gromadzone na papierowych formularzach, które zostaną zaprojektowane przez główną sekcję informatyki GCRC. Rdzeń informatyczny GCRC będzie utrzymywał dane w bezpiecznej bazie danych (Access). Każdemu przedmiotowi zostanie przydzielony unikalny identyfikator odzwierciedlający kolejność, w jakiej nastąpiła rejestracja.

Analiza i prezentacja danych

Jest to badanie pilotażowe, którego celem jest dostarczenie wstępnych danych do przyszłych badań klinicznych. Statystyki opisowe zostaną wykorzystane do scharakteryzowania ETP i roTEG w początkowej fazie posocznicy. Średnie i zakresy zostaną podane dla każdej ze zmiennych w teście wytwarzania trombiny (czas zwłoki, nachylenie wzrostu, wartość szczytowa i pole pod krzywą) oraz roTEG (czas tworzenia skrzepu (CFT), maksymalne tworzenie skrzepu (MCF), maksymalna prędkość (MaxVel) tworzenia się skrzepu, czas do maksymalnej prędkości (T,MaxVel) tworzenia się skrzepu i pole pod krzywą prędkości (AUC)). Głównym celem tego badania jest porównanie ETP podczas prezentacji z rozwojem DIC, określonym przez pozytywny wynik ISTH DIC. Drugorzędnym celem będzie porównanie zmiennych krzepnięcia gospodarza, w tym ETP, roTEG, Pro C, Pro S, ATIII, FVL i mutacji protrombiny G20210A podczas prezentacji, z drugorzędnymi miarami wyniku 28-dniowej śmiertelności i dysfunkcji narządów. Wszystkie statystyki będą wykonywane przy użyciu NCSS/PASS.

Określenie wielkości próbki: Nie ma opublikowanych doniesień na temat testów wytwarzania trombiny lub tromboelastografii w sepsie lub DIC. W naszych poprzednich badaniach pacjentów przyjmujących antykoagulanty (warfarynę) zaobserwowano 400% spadek ETP (1719 do 404). Aby wyprowadzić średnią ETP z docelową szerokością 100 i 95% przedziałem ufności, zakładając odchylenie standardowe 259, będziemy musieli zapisać 100 pacjentów.

Do analizy danych będziemy stosować następujące metody statystyczne:

Cel szczegółowy nr 1: Potencjał endogennej trombiny (ETP) to pole pod krzywą testu wytwarzania trombiny. Wartości są ciągłe i mieszczą się w zakresie od 0 do 2500. Maksymalne tworzenie się skrzepu (MCF) z roTEG będzie również wykorzystywane do oszacowania ETP. Wynik DIC zostanie obliczony i zakodowany jako zmienna dychotomiczna: Tak (wynik > 5) lub Nie (wynik < 5). Krzywa działania odbiornika zostanie wyznaczona dla ETP i MCT oraz jej czułość i swoistość do przewidywania DIC. Jeśli okaże się, że pole pod krzywą jest znaczące, wybrana zostanie optymalna wartość odcięcia o najwyższym stopniu dokładności. Ta wartość zostanie wykorzystana do oszacowania wartości predykcyjnej testu. Pozytywna wartość predykcyjna zostanie obliczona według wzoru: # pacjentów z ETP lub MCT powyżej wartości odcięcia i rozwojem DIC / # pacjentów z dodatnim wynikiem DIC. Wartość predykcyjna ujemnego wyniku DIC zostanie obliczona przy użyciu wzoru: # pacjentów z ETP lub MCT poniżej wartości odcięcia i bez progresji do DIC / # pacjentów z ujemnym wynikiem DIC.

Cel szczegółowy nr 2: Przeprowadzona zostanie analiza wieloczynnikowa w celu określenia, które ze zmiennych predykcyjnych (ETP, MCT, Pro C, Pro S, ATIII, FVL, ProG20210A, DIC) są powiązane z drugorzędowymi dychotomicznymi miarami wyniku: dysfunkcja narządów w 28. dni (dowolny/brak), 28-dniowa śmiertelność (martwy/żywy).