Trombiinin muodostuminen ja tromboelastografia ei-avoimessa DIC:ssä

Koagulaatiojärjestelmän aktivaatio tapahtuu varhaisessa vaiheessa sepsispotilailla, vaikka kliinisesti selvä disseminoitunut intravaskulaarinen koagulaatio (DIC) havaitaan vain pienellä osalla potilaista, joilla on vaikea sepsis. Koagulaatiojärjestelmän hallitsematon aktivaatio voi myötävaikuttaa useiden elinten vajaatoiminnan patofysiologiaan ja sitä seuraavaan sepsiksen sairastumiseen ja kuolleisuuteen. Vaikeaksi sepsikseksi ja DIC:ksi etenemistä ennustavien riskitekijöiden tunnistaminen on ollut vaikeaa. Ehdotamme, että kokoveri- ja solurikkaat hyytymismääritykset parantavat herkkyyttä sekä prokoagulantti- että antikoagulanttimuutoksille, jotka tapahtuvat sepsiksen varhaisessa vaiheessa, ja parantavat ei-avoimen DIC:n tunnistamista. Tulevissa tutkimuksissa selvitetään, onko näillä määrityksillä riittävän korkea ennustearvo, jotta voidaan tunnistaa potilaiden alaryhmät, jotka voisivat hyötyä varhaisesta puuttumisesta.

Erityiset tavoitteet:

1. Oletamme, että lisääntynyt trombiinin muodostuminen edeltää selvän DIC:n kehittymistä kliinisesti merkittävällä ajanjaksolla. Ensisijainen tavoitteemme on määrittää, ennustaako endogeeninen trombiinipotentiaali, joka mitataan sepsiksen ensimmäisen diagnoosin yhteydessä ennen DIC:n ja elinten vajaatoiminnan alkamista, ilmeistä DIC:tä.
2. Terveen väestön välillä on merkittävää yksilöllistä vaihtelua endogeenisen trombiinin muodostumisessa, mikä johtuu hyytymisproteiinien tunnetuista ja tuntemattomista polymorfismista. Ennustamme, että isäntämuuttujat trombiinin muodostumisessa vaikuttavat herkkyyteen DIC:lle ja huonoon lopputulokseen sepsiksen aikana. Tämän tutkimuksen toissijaisena tavoitteena on määrittää, altistavatko isännän koagulaatiomuuttujat sepsikseen liittyvälle sairastuvuus- ja kuolleisuudesta.

Kokeellinen suunnittelu ja menetelmät

Tutkimussuunnitelma on prospektiivinen havaintotutkimus potilaista, jotka saapuvat Memorial Hermann -sairaalan päivystykseen, joilla on sepsis. Sepsiksen kriteerejä ovat ACCP/SCCM-konsensuskonferenssin määrittelemät todisteet systeemisestä tulehdusvasteoireyhtymästä ja tunnetusta tai epäillystä infektiosta. Poissulkemiskriteerit sisältävät ACCP/SCCM-konsensuskonferenssin määrittelemät vakavan sepsiksen tai septisen shokin merkit esityksen yhteydessä, mukaan lukien: elinten toimintahäiriö, hypoperfuusio ja perfuusiohäiriöt. Krooniset sairaudet, jotka liittyvät immuunivasteen heikkenemiseen tai koagulopatioihin, kuten neutropenia ja sirppisolusairaus, sekä immuunijärjestelmän toimintahäiriöihin tai koagulopatioihin johtavien lääkkeiden käyttö, kuten krooninen steroidien käyttö tai antikoagulaatio, ovat myös syitä poissulkemiselle. Lisäksi, koska jokaiselta potilaalta tarvitaan verimäärä laboratoriotutkimuksiin, mukaan otetaan vain potilaat, joiden paino on 25 kg tai enemmän. Tutkimuksesta vetäytyminen tapahtuu hoitavan lääkärin tai tutkittavan harkinnan mukaan. Kaikin keinoin pyritään keräämään kliinisiä tietoja potilailta, jotka ovat vetäytyneet.

Sisällyttämiskriteerit

• Tunnettu tai epäilty infektio hoitavan lääkärin määrittämänä Potilas sairaalahoitoon
• Systeeminen tulehdusreaktiooireyhtymä: 3 seuraavista neljästä kriteeristä:
• Lämpötila > 38 C tai < 35 C
• Syke > 90 lyöntiä/min, paitsi potilailla, joilla on sairaus, jonka tiedetään lisäävän sydämen sykettä tai jotka saavat hoitoa, joka ehkäisee takykardiaa.
• Hengitystiheys > 20 hengitystä/min tai PaC02 < 32 mmHg tai mekaanisella ventilaatiolla akuutissa hengitysprosessissa.
• Valkosolujen määrä > 12 000/mm3, < 4 000/mm3 tai > 10 % vyöhykkeitä

Poissulkemiskriteerit

• - Seuraavien lääkkeiden käyttö: fraktioimaton hepariini aktiivisen tromboottisen tapahtuman hoitoon 8 tunnin sisällä ennen infuusiota; pienimolekyylipainoista hepariinia suurempana annoksena kuin suositeltu profylaktiseen käyttöön 12 tunnin sisällä ennen infuusiota, varfariinia käytetty 7 päivän sisällä tutkimukseen osallistumisesta, aspiriinin käyttö yli 650 mg/vrk annoksella 3 päivää ennen tutkimusta, trombolyyttinen hoito 3 päivää ennen tutkimusta, glykoproteiini IIb/IIIa -antagonistit 7 päivän sisällä ennen tutkimukseen tuloa, aktivoidun proteiini C:n (Xigris) antaminen 24 tuntia ennen tutkimukseen tuloa.
• Neutropenia
• Hemofilia
• Diabeettinen ketoasidoosi
• Paino < 25 kg

Potilaat kirjataan päivystykseen 2 tunnin sisällä tapaamisesta. Potilailta tai heidän valtuutetuilta edustajilta hankitaan kirjallinen tietoinen suostumus. Verinäytteet otetaan perifeerisellä laskimopunktiolla ensimmäisen tunnin aikana rekisteröinnin jälkeen ja sen jälkeen kerran päivässä 7 päivän ajan (katso liite A).

Potilaat poistetaan tutkimuksesta, jos verinäytteitä ei oteta 2 tunnin kuluessa tietoisen suostumuksen saamisesta.

Kliinisen tiedon keruu Kliiniset tietolomakkeet (katso liite B) täytetään ilmoittautumisen yhteydessä ja päivittäin 7 päivän ajan, sairaalasta kotiutumisen yhteydessä ja 28 päivän kuluttua. Kliinikot ovat sokeita laboratoriotutkimusten tuloksiin.

Laboratoriomenetelmät

Veri ja plasma Jokaiselta potilaalta kerätään 15 ml verta ilmoittautumisen yhteydessä. Näytteet otetaan antecubitaalisella laskimopunktiolla. Käytetään vapaata virtausta tai minimaalista imua; tyhjiösäiliöitä vältetään. Näytteet verihiutalehuono plasma (PPP) ja kokoverianalyysiä varten kerätään silikonoituihin lasiputkiin, joissa on 0,105 M trinatriumsitraattia suhteessa 1 osa antikoagulanttia ja 9 osaa kokoverta. PPP erotetaan 60 minuutin kuluessa ja analysoidaan välittömästi. Verihiutalerikas plasma (PRP) -näytteet erotetaan plasmasupernatantin ylemmistä ¾ tilavuudesta sen jälkeen, kun niitä on sentrifugoitu 265 g:llä 10 minuuttia huoneenlämpötilassa. Verihiutaleet lasketaan Beckman Coulter -laskimella ja säädetään arvoon 150 x 109 verihiutaletta/l autologisella PPP:llä. PRP käytetään 60 minuutin kuluessa. Cbc, PT/PTT, fibrinogeeni, d-dimeeri, proteiini C -aktiivisuus, proteiini S -aktiivisuus, ATIII-aktiivisuus, tekijä V Leiden -mutaatio, protrombiini G20210A -mutaatioanalyysi suoritetaan Memorial Herman -sairaalan kliinisissä laboratorioissa.

RoTEG

Kokoverinäytteet otetaan edellä kuvatulla tavalla. Mittaukset suoritetaan kahdella Pentapharm-yhtiön roTEG-koagulaatioanalysaattorilla. Täysmuoviset RoTEG-reaktiokupit hankitaan valmistajalta. Polypropeeni- ja polyeteenipipettejä käytetään reagenssien ja veren käsittelyyn. Sitrattu kokoveri kalsifioidaan uudelleen 20 mcl:lla 0,2 mol/l CaCl2:a ja aktivoidaan 20 mcl:lla rekombinantti ihmisen TF:ää (Innovin) laimennettuna 1:1000 natriumbarbitaalipuskuria käyttäen. Valmistaja on määritellyt mitatut parametrit seuraavasti: Hyytymisaika (CT) on aika sekunteina Ca2+:n koagulaation aktivaatiosta siihen asti, kunnes ordinaatalla saavutetaan 2 graafista mm:ä vastaava elastisuuden lisäys. Hyytymän muodostumisaika (CFT) on aika sekunteina, joka kuluu, kun elastisuus kasvaa 2 mm:stä 20 mm:iin ordinaatalla. Maksimaalinen hyytymän muodostus (MCF) ilmaisee lopullisen hyytymän maksimivoimakkuuden millimetreinä. Sorensen et al 28 ovat määrittäneet useita lisäparametreja, jotka edustavat hyytymän muodostumisen jatkuvaa rekisteröintiä: hyytymän muodostumisen maksiminopeus (MaxVel), aika hyytymän muodostumisen maksiminopeuteen (T,MaxVel) ja nopeuskäyrän alla oleva pinta-ala. (AUC).

Trombiinin sukupolvi

Kalibroidut automatisoidut trombiinin muodostumismittaukset suoritetaan käyttäen Hemker-metodologiaa. 29 Verihiutalerikas plasma (PRP) valmistetaan edellä kuvatulla tavalla. Fluorogeeninen substraatti ja kromogeeninen trombiini ostetaan Thermolabsystemsin kautta ja rekombinantti relipidoitunut kudostekijä (TF) Dade Behringin kautta. Kalibraattorina käytettävä alfa 2 -makroglobuliini-trombiinikompleksi ostetaan Thrombolabsystemsin kautta. Trombogrammit mitataan 96-kuoppaisella levyfluorometrillä (Ascent reader, Thrombolabsystems) ja analysoidaan Thrombinoscopen kautta ostetulla ohjelmistolla. Kokeet suoritetaan neljänä kappaleena ja niitä verrataan kalibraattoriin. Kuhunkin kuoppaan lisätään 80 mcl plasmaa, jota seuraa kalibraattori tai puskuri, sitten "laukaisu": 20 mcl 3 mM TF:ää. Levy asetetaan fluorometriin ja sen annetaan lämmetä 37 C:een. Laite annostelee 20 mcl fluorogeenistä substraattia 2,5 mM ja CaCl2 100 mM (FluCa) kaikkiin mitattaviin kuoppiin, rekisteröi tämän nollaajaksi, ravistaa niitä 10 s ja aloittaa lukemisen. Mittauksen aikana ohjelma vertaa TG:n ja CL:n lukemia, laskee trombiinipitoisuuden ja näyttää trombiinipitoisuuden ajallaan. Trombiinin huippu on korkein trombiinikonsentraatio, joka saavutetaan trombiinin muodostumisen ja eston aikana. Trombiinipotentiaali on trombiinin määrä, joka muodostuu 60 minuutissa (käyrän alla oleva pinta-ala). Viivevaihe ja huippuaika viittaavat trombiinin muodostumisen alkamiseen ja nopeuteen, vastaavasti.

Tiedonhallinta Tiedot kerätään paperilomakkeille, jotka GCRC:n informatiikan ydinosasto suunnittelee. GCRC-informatiikkaydin ylläpitää tietoja suojatussa tietokannassa (Access). Jokaiselle koehenkilölle annetaan yksilöllinen tunnus, joka kuvastaa ilmoittautumisjärjestystä.

Tietojen analysointi ja esittely

Tämä on pilottitutkimus, jonka tarkoituksena on tarjota alustavia tietoja tulevia kliinisiä tutkimuksia varten. Kuvaavia tilastoja käytetään ETP:n ja roTEG:n karakterisoimiseen sepsiksen ensiesittelyssä. Keskiarvot ja vaihteluvälit raportoidaan kullekin muuttujalle trombiinin muodostumismäärityksessä (viiveaika, nousun kaltevuus, huippuarvo ja käyrän alla oleva pinta-ala) ja roTEG (hyytymän muodostumisaika (CFT), maksimaalinen hyytymän muodostus (MCF), hyytymän muodostumisen maksiminopeus (MaxVel), aika maksiminopeuteen (T,MaxVel) ja nopeuskäyrän alla oleva pinta-ala (AUC)). Tämän tutkimuksen ensisijaisena tavoitteena on verrata ETP:tä esittelyssä DIC:n kehittymiseen, joka määritellään positiivisella ISTH DIC -pisteellä. Toissijaisena tavoitteena on verrata isännän hyytymismuuttujia, mukaan lukien ETP-, roTEG-, Pro C-, Pro S-, ATIII-, FVL- ja protrombiini G20210A -mutaatio esittelyhetkellä, 28 päivän kuolleisuuden ja elinten toimintahäiriön toissijaisiin tulosmittauksiin. Kaikki tilastot tehdään NCSS/PASS-protokollalla.

Näytteen koon määritys: Trombiinin muodostusmäärityksistä tai tromboelastografiasta sepsiksessä tai DIC:ssä ei ole julkaistuja raportteja. Aiemmissa tutkimuksissamme potilailla, jotka käyttivät antikoagulanttia (varfariinia), ETP:n lasku oli 400 % (1719-404). Jotta saataisiin keskimääräinen ETP, jonka tavoiteleveys on 100 ja luottamusväli 95 %, jos oletetaan, että standardipoikkeama on 259, meidän on rekisteröitävä 100 potilasta.

Käytämme seuraavia tilastollisia menetelmiä tietojen analysointiin:

Erityinen tavoite #1: Endogeeninen trombiinipotentiaali (ETP) on trombiinin muodostumismäärityksen käyrän alla oleva alue. Arvot ovat jatkuvia ja vaihtelevat välillä 0 - 2500. Maksimaalista hyytymän muodostumista (MCF) roTEG:stä käytetään myös ETP:n arvioimiseen. DIC-pistemäärä lasketaan ja koodataan kaksijakoiseksi muuttujaksi: Kyllä (pistemäärä > 5) tai Ei (pistemäärä < 5). Vastaanottimen toimintakäyrä johdetaan ETP:lle ja MCT:lle sekä sen herkkyydestä ja spesifisyydestä DIC:n ennustamiseksi. Jos käyrän alla oleva pinta-ala todetaan merkittäväksi, valitaan optimaalinen raja-arvo, jolla on suurin tarkkuus. Tätä arvoa käytetään testin ennustusarvon arvioimiseen. Positiivinen ennustearvo lasketaan kaavalla: # potilasta, joilla ETP tai MCT ylittää raja-arvon, ja DIC:n kehittyminen / # potilasta, joilla on positiivinen DIC-pistemäärä. Negatiivisen DIC-pistemäärän ennustearvo lasketaan käyttämällä kaavaa: # potilasta, joilla on ETP tai MCT alle raja-arvon ja ei etene DIC:ksi / # potilasta, joilla on negatiivinen DIC-pistemäärä.

Erityinen tavoite #2: Tehdään monimuuttujaanalyysi sen määrittämiseksi, mitkä ennustemuuttujista (ETP, MCT, Pro C, Pro S, ATIII, FVL, ProG20210A, DIC) liittyvät sekundaarisiin kaksijakoisiin tulosmittauksiin: elinten toimintahäiriö 28-vuotiaana päivää (kaikki/ei mitään), 28 päivän kuolleisuus (kuollut/elossa).