Generazione di trombina e tromboelastografia nella DIC non conclamata

L'attivazione del sistema di coagulazione si verifica precocemente nei pazienti con sepsi, sebbene la coagulazione intravascolare disseminata (CID) clinicamente manifesta sia identificata solo in una minoranza di pazienti con sepsi grave. L'attivazione incontrollata del sistema di coagulazione può contribuire alla fisiopatologia dell'insufficienza multiorgano e alla conseguente morbilità e mortalità della sepsi. L'identificazione dei fattori di rischio che predicono la progressione verso la sepsi grave e la CID è stata sfuggente. Proponiamo che i saggi di coagulazione del sangue intero e ricchi di cellule offrano una migliore sensibilità sia ai cambiamenti procoagulanti che anticoagulanti che si verificano all'inizio della sepsi e miglioreranno il riconoscimento della DIC non evidente. Studi futuri esamineranno se questi test hanno un valore predittivo sufficientemente elevato per identificare sottogruppi di pazienti che potrebbero beneficiare di un intervento precoce.

Obiettivi specifici:

1. Ipotizziamo che l'aumento della generazione di trombina precederà lo sviluppo di una CID conclamata di un periodo di tempo clinicamente significativo. Il nostro obiettivo primario è determinare se il potenziale endogeno di trombina misurato alla prima diagnosi di sepsi prima dell'insorgenza di CID e insufficienza d'organo è predittivo di CID conclamato.
2. Esiste una significativa variazione individuale tra la popolazione sana nella generazione endogena di trombina a causa di polimorfismi noti e sconosciuti all'interno delle proteine ​​della coagulazione. Prevediamo che le variabili dell'ospite nella generazione di trombina contribuiranno alla suscettibilità alla DIC e allo scarso esito durante la sepsi. Un obiettivo secondario di questo studio è determinare se le variabili della coagulazione dell'ospite predispongono alla morbilità e alla mortalità associate alla sepsi.

Progettazione e metodi sperimentali

Il disegno dello studio sarà uno studio osservazionale prospettico di pazienti che si presentano al Pronto Soccorso del Memorial Hermann Hospital con sepsi. I criteri per la sepsi includono evidenza di sindrome da risposta infiammatoria sistemica come definita dalla conferenza di consenso ACCP/SCCM e un'infezione nota o sospetta. I criteri di esclusione includono segni di sepsi grave o shock settico, come definito dalla ACCP/SCCM Consensus Conference, alla presentazione, tra cui: disfunzione d'organo, ipoperfusione e anomalie della perfusione. Anche le condizioni mediche croniche associate alla soppressione immunitaria o alle coagulopatie, come la neutropenia e l'anemia falciforme, e l'uso di farmaci che portano a disfunzioni immunitarie o coagulopatie, come l'uso cronico di steroidi o anticoagulanti, saranno motivi di esclusione. Inoltre, a causa del volume di sangue richiesto a ciascun paziente per gli studi di laboratorio, verranno arruolati solo pazienti di peso corporeo pari o superiore a 25 kg. Il ritiro dallo studio sarà a discrezione del medico curante o del soggetto. Verranno compiuti tutti gli sforzi per raccogliere informazioni cliniche dai pazienti che si sono ritirati.

Criterio di inclusione

• Infezione nota o sospetta stabilita dal medico curante Paziente da ricoverare in ospedale
• Sindrome da risposta infiammatoria sistemica: 3 dei seguenti 4 criteri:
• Temperatura > 38 C o < 35 C
• Frequenza cardiaca > 90 battiti/min, eccetto nei pazienti con una condizione medica nota per aumentare la frequenza cardiaca o coloro che ricevono un trattamento che previene la tachicardia.
• Frequenza respiratoria > 20 respiri/min o PaC02 < 32 mmHg, o in ventilazione meccanica per un processo respiratorio acuto.
• Conta leucocitaria > 12.000/mm3, < 4.000/mm3 o bande > 10%

Criteri di esclusione

• - Uso dei seguenti farmaci: eparina non frazionata per il trattamento di un evento trombotico attivo nelle 8 ore precedenti l'infusione; eparina a basso peso molecolare a una dose più elevata di quella raccomandata per l'uso profilattico entro 12 ore prima dell'infusione, warfarin utilizzato entro 7 giorni dall'ingresso nello studio, uso di aspirina a una dose superiore a 650 mg/giorno entro 3 giorni prima dello studio, terapia trombolitica entro 3 giorni prima dello studio, antagonisti della glicoproteina IIb/IIIa entro 7 giorni prima dell'ingresso nello studio, somministrazione di proteina C attivata (Xigris) nelle 24 ore prima dell'ingresso nello studio.
• Neutropenia
• Emofilia
• Chetoacidosi diabetica
• Peso < 25 kg

I pazienti saranno arruolati nel pronto soccorso entro 2 ore dal raggiungimento dell'idoneità. Il consenso informato scritto sarà ottenuto dai pazienti o dai loro rappresentanti autorizzati. I campioni di sangue saranno raccolti mediante venipuntura periferica durante la prima ora dopo l'arruolamento e poi una volta al giorno per 7 giorni (vedi Appendice A).

I pazienti verranno ritirati dallo studio se il prelievo di sangue non viene eseguito entro 2 ore dall'ottenimento del consenso informato.

Raccolta dei dati clinici I moduli dei dati clinici (vedere Appendice B) saranno completati al momento dell'arruolamento e giornalmente per 7 giorni, alla dimissione ospedaliera ea 28 giorni. I medici saranno all'oscuro dei risultati dei test di laboratorio di ricerca.

Metodi di laboratorio

Sangue e plasma Ogni paziente avrà 15 ml di sangue raccolti al momento dell'arruolamento. I campioni saranno ottenuti mediante venopuntura antecubitale. Verrà impiegato il flusso libero o l'aspirazione minima; saranno evitati i contenitori sottovuoto. I campioni per l'analisi del plasma povero di piastrine (PPP) e del sangue intero saranno raccolti in tubi di vetro siliconato con citrato trisodico 0,105 M nel rapporto di 1 parte di anticoagulante per 9 parti di sangue intero. Il PPP verrà separato entro 60 minuti e analizzato immediatamente. I campioni di plasma ricco di piastrine (PRP) saranno separati dai ¾ del volume superiore del surnatante plasmatico dopo centrifugazione a 265 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Le piastrine saranno contate su un contatore Beckman Coulter e aggiustate a 150 X 109 piastrine/l con PPP autologo. Il PRP verrà utilizzato entro 60 minuti. L'analisi di Cbc, PT/PTT, fibrinogeno, d-dimero, attività della proteina C, attività della proteina S, attività ATIII, mutazione del fattore V Leiden, mutazione della protrombina G20210A sarà eseguita nei laboratori clinici del Memorial Herman Hospital.

RoTEG

I campioni di sangue intero verranno prelevati come descritto sopra. Le misurazioni saranno eseguite su due analizzatori di coagulazione roTEG della Pentapharm. Le tazze di reazione interamente in plastica RoTEG vengono acquistate dal produttore. Le pipette in polipropilene e polietilene vengono utilizzate per maneggiare i reagenti e il sangue. Il sangue intero citrato sarà ricalcificato con 20 mcl 0.2 mol/L CaCl2 e attivato con 20 mcl di soluzione di TF umano ricombinante (Innovin) diluito 1:1000 utilizzando un tampone barbital sodico. I parametri misurati sono stati definiti dal produttore come segue: Il tempo di coagulazione (CT) è il tempo in secondi dall'attivazione della coagulazione del Ca2+ fino all'ottenimento in ordinata di un aumento dell'elasticità corrispondente a 2 mm grafici. Il tempo di formazione del coagulo (CFT) è il tempo in secondi che trascorre mentre l'elasticità aumenta da 2 mm a 20 mm in ordinata. La massima formazione di coaguli (MCF) esprime la massima forza in millimetri del coagulo finale. Diversi parametri aggiuntivi che rappresentano la registrazione continua della formazione del coagulo sono stati definiti da Sorensen et al 28: la velocità massima (MaxVel) della formazione del coagulo, il tempo alla velocità massima (T,MaxVel) della formazione del coagulo e l'area sotto la curva di velocità (AUC).

Generazione di trombina

Le misurazioni automatiche calibrate della generazione di trombina saranno eseguite utilizzando la metodologia Hemker. 29 Il plasma ricco di piastrine (PRP) sarà preparato come descritto sopra. Il substrato fluorogenico e la trombina cromogenica saranno acquistati tramite Thermolabsystems e il fattore tissutale ricombinante rilipidato (TF) tramite Dade Behring. Il complesso alfa 2 macroglobulina-trombina utilizzato come calibratore sarà acquistato tramite Thrombolabsystems. I trombogrammi saranno misurati in un fluorimetro a 96 pozzetti (Ascent reader, Thrombolabsystems) e analizzati con software acquistato tramite Thrombinoscope. Gli esperimenti saranno condotti in quadruplicato e confrontati con un calibratore. Ad ogni pozzetto verranno aggiunti 80 mcl di plasma, seguiti dal calibratore o tampone, poi il "trigger": 20 mcl di 3 mM di TF. La piastra verrà posta nel fluorimetro e lasciata riscaldare a 37 C. Lo strumento dispensa 20 mcl di substrato Fluorogenico 2.5 mM e CaCl2 100 mM (FluCa) a tutti i pozzetti da misurare, lo registra come tempo zero, li agita per 10 s e inizia la lettura. Durante la misurazione, il programma confronta le letture del TG e del CL, calcola la concentrazione di trombina e visualizza la concentrazione di trombina nel tempo. Il picco di trombina è la più alta concentrazione di trombina raggiunta durante il corso temporale della formazione e dell'inibizione della trombina. Il potenziale di trombina è la quantità di trombina che si forma in 60 minuti (Area sotto la curva). La fase di ritardo e il tempo di picco si riferiscono rispettivamente all'inizio e alla velocità di formazione della trombina.

Gestione dei dati I dati saranno raccolti su moduli cartacei che saranno progettati dalla sezione centrale di informatica del GCRC. Il nucleo informatico GCRC manterrà i dati su un database sicuro (Access). Ad ogni soggetto verrà assegnato un ID univoco che riflette l'ordine in cui è avvenuta l'iscrizione.

Analisi e presentazione dei dati

Questo è uno studio pilota destinato a fornire i dati preliminari per futuri studi clinici. Le statistiche descrittive saranno utilizzate per caratterizzare ETP e roTEG alla presentazione iniziale della sepsi. Le medie e gli intervalli saranno riportati per ciascuna delle variabili nel test di generazione della trombina (tempo di ritardo, pendenza dell'aumento, valore di picco e area sotto la curva) e roTEG (tempo di formazione del coagulo (CFT), formazione massima del coagulo (MCF), velocità massima (MaxVel) di formazione del coagulo, tempo alla velocità massima (T,MaxVel) di formazione del coagulo e area sotto la curva di velocità (AUC)). L'obiettivo principale di questo studio è confrontare l'ETP alla presentazione con lo sviluppo di DIC, come definito da un punteggio ISTH DIC positivo. L'obiettivo secondario sarà confrontare le variabili della coagulazione dell'ospite, tra cui ETP, roTEG, Pro C, Pro S, ATIII, FVL e la mutazione della protrombina G20210A alla presentazione, con le misure di esito secondario della mortalità a 28 giorni e della disfunzione d'organo. Tutte le statistiche verranno eseguite utilizzando NCSS/PASS.

Determinazione della dimensione del campione: non ci sono segnalazioni pubblicate di test di generazione di trombina o tromboelastografia nella sepsi o CID. Nei nostri precedenti studi su pazienti che assumevano un anticoagulante (warfarin), c'era un decremento del 400% di ETP (da 1719 a 404). Per derivare un ETP medio con un'ampiezza target di 100 e un intervallo di confidenza del 95%, assumendo una deviazione standard di 259, avremo bisogno di arruolare 100 pazienti.

Impiegheremo i seguenti metodi statistici per l'analisi dei dati:

Obiettivo specifico n. 1: Il potenziale endogeno di trombina (ETP) è l'area sotto la curva del test di generazione della trombina. I valori sono continui e vanno da 0 a 2.500. Anche la massima formazione di coaguli (MCF) dal roTEG verrà utilizzata per approssimare l'ETP. Il punteggio DIC sarà calcolato e codificato come variabile dicotomica: Sì (punteggio > 5) o No (punteggio < 5). Verrà derivata una curva operativa del ricevitore per ETP e MCT e la sua sensibilità e specificità per predire DIC. Se l'area sotto la curva risulta significativa, verrà scelto un valore di cut-off ottimale con il massimo grado di accuratezza. Questo valore verrà utilizzato per stimare il valore predittivo del test. Il valore predittivo positivo sarà calcolato con la formula: # pazienti con ETP o MCT al di sopra del cut-off e sviluppo di DIC / # pazienti con punteggio DIC positivo. Il valore predittivo di un punteggio DIC negativo sarà calcolato utilizzando la formula: # pazienti con ETP o MCT al di sotto del cut-off e nessuna progressione a DIC / # pazienti con punteggio DIC negativo.

Obiettivo specifico n. 2: verrà eseguita un'analisi multivariata per determinare quali delle variabili predittive (ETP, MCT, Pro C, Pro S, ATIII, FVL, ProG20210A, DIC) sono associate alle misure di esito dicotomiche secondarie: disfunzione d'organo a 28 giorni (Qualsiasi/Nessuno), mortalità a 28 giorni (Dead/Alive).