脳側副制御に関与するマイクロRNAの同定 (microRNA)

オハイオ州立大学 (OSU) ウェクスナー医療センターの救急科を受診し、急性虚血性脳卒中を患っている 18 歳以上の患者がスクリーニングされます。 研究者には、突然の急性大血管閉塞（LVO）に続発する前循環性急性虚血性脳卒中の患者が含まれます。 健康な被験者は、脳卒中集団に固有のmiRNAを評価するためのコントロールとして使用されます。 血行力学的に重要な既存の狭窄はmiRNA発現の変化をもたらす可能性があるため、研究者は内頸動脈（ICA）の50％以上の狭窄、両側椎骨動脈の50％以上の狭窄、および中等度から重度の頭蓋内アテローム性動脈硬化症の患者を除外します。頭頸部の CT Angiogram (CTA) で見られるように。 交絡因子を最小限に抑えるために、既知の中等度から重度の末梢血管疾患または症候性冠動脈疾患を有し、ステントまたは冠動脈バイパス移植の既往がある患者も除外されます。 囚人および妊娠中の女性もこの研究から除外されます。健康な対照と比較した急性LVO患者のエキソソームマイクロRNAの発現差が評価されます。 さらに、神経放射線科医は、検証済みの側副採点法を使用して各患者の CTA および CT 灌流 (CTP) 研究を慎重に検討した後、脳側副循環を (i) 良好または (ii) 不良として等級付けします。 15 人の健常対照者 (n=45) に加えて、大血管閉塞を伴う 30 人の患者がこの研究に登録されます。 血液サンプルは、各患者の症状の発症から 4 つの異なる時点で採取されます: (i) 0 ～ 6 時間、(ii) 6 ～ 12 時間、(iii) 12 ～ 24 時間、および (iv) 5 ～ 7 日。 さまざまな担保グレードを持つ患者間で異なるmiRNA発現も評価されます

側副成熟のプロセスは、LVO によって誘発された血行動態の変化の直後に始まる可能性が高いため、研究者は 0 ～ 6 時間以内に最初のサンプルを収集する予定です。 最初の 24 時間に 3 つの血液サンプルを採取して、側副リモデリング プロセスの開始時に miRNA 発現プロファイルを取得できる可能性を高めます。 次に、これらの患者の miRNA プロファイルを分析し、健康なボランティアと比較します。 さらに、脳側副グレードが良好な患者と不良な患者との比較を行います。これらの患者のmiRNAプロファイルを、以下に説明する方法を使用して分析します。

エキソソームの分離と特徴付け: エキソソームの数とサイズの定量化は、前述のように、OSU CCC Analytical Cytometry Core で NanoSight NS300 (Nanosight、英国) を使用して実行されます。 簡単に言えば、製造元の指示に従って、Total Exosome Isolation Kit (Invitrogen) を使用して、無細胞血漿からエキソソームを分離します。 エキソソームは PBS バッファーに懸濁し、4°C で最大 7 日間保存します。 その後、エクソソーム懸濁液を希釈して、NanoSight NS300 で使用するための 2 x 108 ～ 8 x 108 の作業濃度を達成した後、エクソソームをカウントしてサイズを決定します11。

総 RNA の分離: 全 RNA は、前述の循環核酸抽出キット (Qiagen) を使用して、PBS に懸濁したエキソソームから分離されます 12。 DNA 汚染は Qiagen の RNase フリー DNase セットを使用することで軽減されます。 記載されているように、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＲＮＡを濃縮および精製する。

NanoString アッセイ: オハイオ州立大学 CCC ゲノミクス共有リソースの多重 nanoString nCounter miRNA システム (nanoString Technologies) は、説明されているように miRNA 発現プロファイリングに使用されます 12。 エキソソームから分離されたトータル RNA (100ng) が入力材料として使用されます。 small RNA サンプルは、製造元の指示 (nanoString Technologies) に従って成熟 miRNA の 3' 末端に特定の DNA タグをライゲーションすることにより調製されます。 これらのタグは、miRNA の融解温度を正規化し、サンプル内の各 miRNA 種の識別を提供します。 過剰なタグは洗い流され、得られた材料は miRNA:tag 特異的な nCounter レポーター プローブとハイブリダイズします。 次に、ハイブリダイズしたプローブを精製し、nCounter Prep Station (nanoString Technologies) を使用してストレプトアビジンでコーティングされたカートリッジに固定します。 nCounter Digital Analyzer を使用して、個々の蛍光バーコードをカウントし、各サンプルに存在する miRNA 分子を定量化します。

miRNA 発現プロファイルの正規化と分析: 品質管理、正規化、およびデータ分析は、前述のように nSolver 2.0 分析ソフトウェア (nanoString Technologies) を使用して実行されます。 nanoString クエリによって識別された miRNA の階層的クラスタリングは、dChip (v 1.3) ソフトウェアを使用して行われます。 担保スコアが良好または不良の患者で示差的に発現するmiRNA（上記のとおり）は、p<0.05の有意水準での一元配置分散分析（ANOVA）アッセイを使用して、2倍を超えるまたは未満の変化によって定義されます。誤検出率の補正あり。

エキソソーム miRNA の RT-PCR 検証: エキソソームから分離された miRNA を選択し、miRCURY LNA ユニバーサル cDNA 合成キット (Exiqon) を使用して、前述のように製造元のプロトコルに従って逆転写します。 Mx3000P qPCR プラットフォームで ExiLENT SYBR Green (Exiqon) を使用したリアルタイム PCR によって miRNA を定量化し、発現をハウスキーピング リファレンス (すなわち SNORD44)。