Identyfikacja mikroRNA zaangażowanych w regulację zabezpieczeń mózgowych (microRNA)

Pacjenci w wieku >18 lat zgłaszający się na oddział ratunkowy w Centrum Medycznym Wexner Uniwersytetu Stanowego Ohio (OSU) z ostrym udarem niedokrwiennym zostaną poddani badaniu przesiewowemu. Badacze będą obejmować pacjentów z ostrym udarem niedokrwiennym przedniego krążenia wtórnym do nagłej ostrej niedrożności dużych naczyń (LVO). Zdrowi uczestnicy zostaną wykorzystani jako kontrole do oceny miRNA specyficznych dla populacji z udarem. Ponieważ istniejące hemodynamicznie istotne zwężenie może skutkować zmianą ekspresji miRNA, badacze wykluczą pacjentów ze zwężeniem tętnicy szyjnej wewnętrznej >50% (ICA), >50% zwężeniem tętnic kręgowych obustronnych, a także pacjentów z umiarkowaną lub ciężką chorobą miażdżycową wewnątrzczaszkową jak widać na angiogramie CT (CTA) głowy i szyi. Aby zminimalizować czynniki zakłócające, wykluczeni zostaną również pacjenci ze stwierdzoną chorobą naczyń obwodowych o nasileniu umiarkowanym do ciężkiego lub objawową chorobą wieńcową, u których w przeszłości zastosowano stent lub pomostowanie aortalno-wieńcowe. Więźniowie i kobiety w ciąży również zostaną wykluczeni z tego badania. Oceniona zostanie różnica w ekspresji egzosomalnych mikroRNA u pacjentów z ostrym LVO w porównaniu ze zdrowymi osobami z grupy kontrolnej. Ponadto neuroradiolog oceni krążenie oboczne mózgowe jako (i) dobre lub (ii) słabe, po dokładnym przejrzeniu badań CTA i CT perfuzji (CTP) u każdego pacjenta przy użyciu zwalidowanej metody punktacji krążenia obocznego. Trzydziestu pacjentów z niedrożnością dużych naczyń zostanie włączonych do tego badania oprócz 15 zdrowych osób z grupy kontrolnej (n=45). Próbki krwi będą pobierane w 4 różnych punktach czasowych od wystąpienia objawów dla każdego pacjenta: (i) 0-6 godzin, (ii) 6-12 godzin, (iii) 12-24 godzin i (iv) 5-7 dni. Zróżnicowana ekspresja MiRNA zostanie również oceniona między pacjentami z różnymi stopniami zabezpieczenia

Ponieważ proces dojrzewania obocznego prawdopodobnie rozpoczyna się wkrótce po zmianach hemodynamicznych wywołanych przez LVO, badacze planują pobrać pierwszą próbkę w ciągu 0-6 godzin. W ciągu pierwszych 24 godzin zostaną pobrane trzy próbki krwi, aby zwiększyć szanse na uchwycenie profilu ekspresji miRNA na początku procesu przebudowy zabezpieczenia. Profile miRNA tych pacjentów zostaną następnie przeanalizowane i porównane ze zdrowymi ochotnikami. Ponadto zostanie przeprowadzone porównanie między pacjentami z dobrym i złym stopniem zabezpieczenia mózgowego. Przeanalizujemy profile miRNA tych pacjentów za pomocą metod opisanych poniżej.

Izolacja i charakterystyka egzosomów: Kwantyfikacja liczby i wielkości egzosomów zostanie przeprowadzona przy użyciu NanoSight NS300 (Nanosight, Wielka Brytania) w OSU CCC Analytical Cytometry Core, jak opisano wcześniej. W skrócie, egzosomy zostaną wyizolowane z osocza wolnego od komórek przy użyciu zestawu Total Exosome Isolation Kit (Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta. Egzosomy zostaną zawieszone w buforze PBS i przechowywane w temperaturze 4°C przez okres do 7 dni. Zawiesina egzosomów zostanie następnie rozcieńczona w celu uzyskania stężenia roboczego między 2 x 108 - 8 x 108 do użycia w NanoSight NS300, po czym egzosomy zostaną policzone i zwymiarowane11.

Izolacja całkowitego RNA: Całkowity RNA zostanie wyizolowany z egzosomów zawieszonych w PBS przy użyciu zestawu do ekstrakcji krążącego kwasu nukleinowego (Qiagen), jak opisano wcześniej12. Zanieczyszczenie DNA zostanie złagodzone dzięki zastosowaniu zestawu DNaz wolnych od RNaz firmy Qiagen. RNA zostanie zatężone i oczyszczone przy użyciu zestawu RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen) zgodnie z opisem.

Test NanoString: Zmultipleksowany system miRNA nanoString nCounter (nanoString Technologies) na Uniwersytecie Stanowym Ohio CCC Genomics Shared Resource zostanie użyty do profilowania ekspresji miRNA zgodnie z opisem12. Jako materiał wejściowy zostanie użyty całkowity RNA (100 ng) wyizolowany z egzosomów. Małe próbki RNA zostaną przygotowane poprzez ligację określonego znacznika DNA na końcu 3' dojrzałych miRNA zgodnie z instrukcjami producenta (nanoString Technologies). Znaczniki te normalizują temperatury topnienia miRNA i zapewniają identyfikację każdego gatunku miRNA w próbce. Nadmiar znaczników zostanie wypłukany, a uzyskany materiał będzie hybrydyzowany z sondami reporterowymi nCounter specyficznymi dla znacznika miRNA: znacznik. Zhybrydyzowane sondy zostaną następnie oczyszczone i unieruchomione na kartridżu pokrytym streptawidyną przy użyciu nCounter Prep Station (nanoString Technologies). Cyfrowy analizator nCounter będzie używany do zliczania poszczególnych fluorescencyjnych kodów kreskowych i oznaczania ilościowego cząsteczek miRNA obecnych w każdej próbce.

Normalizacja i analizy profilu ekspresji miRNA: Kontrola jakości, normalizacja i analizy danych zostaną przeprowadzone przy użyciu oprogramowania analitycznego nSolver 2.0 (nanoString Technologies), jak opisano wcześniej. Hierarchiczne grupowanie miRNA zidentyfikowanych za pomocą zapytania nanoString zostanie przeprowadzone przy użyciu oprogramowania dChip (v 1.3). Różnie eksprymowane miRNA u pacjentów z dobrymi lub słabymi wynikami dodatkowymi (jak opisano powyżej) będą definiowane przez większą lub mniejszą niż 2-krotną zmianę przy użyciu testu jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z poziomem istotności p <0,05 i z poprawką na współczynnik fałszywych odkryć.

Walidacja RT-PCR egzosomalnych miRNA: Wybrane miRNA wyizolowane z egzosomów zostaną poddane odwrotnej transkrypcji przy użyciu uniwersalnego zestawu do syntezy cDNA miRCURY LNA (Exiqon) zgodnie z protokołem producenta, jak opisano wcześniej. miRNA będą oznaczane ilościowo metodą PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu ExiLENT SYBR Green (Exiqon) na platformie Mx3000P qPCR, z ekspresją znormalizowaną do wzorca porządkowego (tj. SNORD44).