Az agyi kollaterális szabályozásban részt vevő mikroRNS-ek azonosítása (microRNA)

Az Ohio Állami Egyetem (OSU) Wexner Medical Center sürgősségi osztályán jelentkező, akut ischaemiás stroke-ban szenvedő 18 év feletti betegeket kiszűrik. A kutatók között olyan betegek is részt vesznek, akik akut ischaemiás stroke-ban szenvednek elülső keringésben, másodlagosan a hirtelen akut nagy érelzáródás (LVO) következtében. Egészséges alanyokat használunk kontrollként a stroke populációra specifikus miRNS-ek értékelésére. Mivel a hemodinamikailag szignifikáns, már meglévő szűkület a miRNS-expresszió megváltozását eredményezheti, a kutatók kizárják azokat a betegeket, akiknél az arteria carotis interna (ICA) szűkülete >50%, a kétoldali vertebralis artériák >50%-a, valamint a közepesen súlyos vagy súlyos intracranialis atheroscleroticus betegségben szenvedő betegek. amint az a fej és a nyak CT-angiogramján (CTA) látható. A zavaró tényezők minimalizálása érdekében az ismerten közepesen súlyos vagy súlyos perifériás érbetegségben vagy tünetekkel járó koszorúér-betegségben szenvedő betegek, akiknek anamnézisében stent vagy koszorúér bypass graft szerepel, szintén kizárásra kerülnek. A foglyokat és a terhes nőket szintén kizárják ebből a vizsgálatból. Értékelni fogják az exoszomális mikroRNS-ek eltérő expresszióját akut LVO-ban szenvedő betegekben az egészséges kontrollokhoz képest. Ezenkívül a neuroradiológus az agyi kollaterális keringést (i) jóra vagy (ii) rosszra minősíti, miután minden egyes betegnél gondosan áttekintette a CTA és CT perfúziós (CTP) vizsgálatokat validált kollaterális pontozási módszerrel. Ebbe a vizsgálatba harminc, nagy érelzáródásban szenvedő beteget vonnak be 15 egészséges kontrollon kívül (n=45). A vérmintákat a tünetek megjelenésétől számítva 4 különböző időpontban veszik minden betegnél: (i) 0-6 óra, (ii) 6-12 óra, (iii) 12-24 óra és (iv) 5-7 nap. A differenciált MiRNS expressziót a különböző kollaterális fokozatú betegek között is értékeljük

Mivel a biztosíték érésének folyamata valószínűleg röviddel az LVO által kiváltott hemodinamikai változások után kezdődik, a kutatók azt tervezik, hogy az első mintát 0-6 órán belül begyűjtik. Az első 24 órában három vérmintát vesznek, hogy növeljék a miRNS-expressziós profil rögzítésének esélyét a kollaterális remodelling folyamat elején. Ezeknek a betegeknek a miRNS-profiljait ezután elemzik és összehasonlítják egészséges önkéntesekkel. Ezen túlmenően összehasonlításra kerül sor a jó és a rossz agyi kollaterális fokozatú betegek között. E betegek miRNS-profiljait az alábbiakban ismertetett módszerekkel elemezzük.

Exoszóma izolálása és jellemzése: Az exoszómák számának és méretének kvantifikálása NanoSight NS300 (Nanosight, Egyesült Királyság) segítségével történik az OSU CCC Analytical Cytometry Core-ban a korábban leírtak szerint. Röviden, az exoszómákat sejtmentes plazmából izoláljuk Total Exosome Isolation Kit (Invitrogen) segítségével, a gyártó utasításai szerint. Az exoszómákat PBS-pufferben szuszpendáljuk, és 4 °C-on tároljuk legfeljebb 7 napig. Az exoszóma-szuszpenziót ezután úgy hígítják, hogy elérjék a 2 × 108 és 8 × 108 közötti munkakoncentrációt a NanoSight NS300-ban való felhasználáshoz, majd megszámolják az exoszómákat, és meg fogják méretezni11.

Teljes RNS izolálás: A teljes RNS-t PBS-ben szuszpendált exoszómákból izoláljuk a Circulating Nucleic Acid Extraction Kit (Qiagen) segítségével, a korábban leírtak szerint12. A DNS-szennyeződést a Qiagen RNáz-mentes DNáz készletének használatával csökkentjük. Az RNS-t koncentráljuk és tisztítjuk az RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen) segítségével a leírtak szerint.

NanoString Assay: Az Ohio Állami Egyetem CCC Genomics Shared Resource multiplex nanoString nCounter miRNS rendszerét (nanoString Technologies) fogják használni a miRNS expressziós profilalkotáshoz a leírtak szerint12. Bemeneti anyagként az exoszómákból izolált teljes RNS-t (100 ng) használjuk fel. Kis RNS-mintákat készítünk úgy, hogy egy specifikus DNS-címkét ligálnak az érett miRNS-ek 3'-végére a gyártó utasításai szerint (nanoString Technologies). Ezek a címkék normalizálják a miRNS-ek olvadási hőmérsékletét, és azonosítják a mintában lévő minden miRNS-fajt. A felesleges címkéket lemossuk, és a kapott anyagot miRNS:tag-specifikus nCounter riporter próbákkal hibridizáljuk. A hibridizált szondákat ezután megtisztítják és egy streptavidinnel bevont kazettán rögzítik az nCounter Prep Station (nanoString Technologies) segítségével. Az nCounter Digital Analyzert az egyes fluoreszcens vonalkódok megszámlálására és az egyes mintákban jelenlévő miRNS-molekulák számszerűsítésére fogják használni.

miRNA-kifejezési profil normalizálása és elemzése: A minőség-ellenőrzést, a normalizálást és az adatelemzést az nSolver 2.0 elemzőszoftver (nanoString Technologies) segítségével hajtják végre a korábban leírtak szerint. A nanoString lekérdezéssel azonosított miRNS-ek hierarchikus klaszterezése dChip (v 1.3) szoftverrel történik. A jó vagy gyenge kollaterális pontszámú betegekben (a fent leírtak szerint) a differenciálisan expresszált miRNS-ek meghatározása egyirányú varianciaanalízis (ANOVA) vizsgálattal, nagyobb vagy kevesebb, mint 2-szeres változással történik p<0,05 szignifikanciaszint mellett. hamis felfedezési arány korrekciójával.

Exoszomális miRNS-ek RT-PCR validálása: Az exoszómákból izolált kiválasztott miRNS-ek reverz átírása megtörténik a miRCURY LNA univerzális cDNS-szintézis készlet (Exiqon) segítségével a gyártó által korábban leírtak szerint. A miRNS-ek mennyiségi meghatározása valós idejű PCR-rel történik, ExiLENT SYBR Green (Exiqon) használatával Mx3000P qPCR platformon, az expressziót a háztartási referenciaértékre normalizálva (pl. SNORD44).