Identificazione dei microRNA coinvolti nella regolazione del collaterale cerebrale (microRNA)

Saranno sottoposti a screening i pazienti di età >18 anni che si presentano al pronto soccorso presso il Wexner Medical Center della Ohio State University (OSU) con ictus ischemico acuto. Gli investigatori includeranno pazienti con ictus ischemico acuto della circolazione anteriore secondario a improvvisa occlusione acuta dei grandi vasi (LVO). Soggetti sani saranno usati come controlli per valutare i miRNA specifici per la popolazione colpita da ictus. Poiché una stenosi preesistente emodinamicamente significativa può comportare un'alterazione dell'espressione di miRNA, i ricercatori escluderanno i pazienti con stenosi> 50% dell'arteria carotide interna (ICA), stenosi> 50% delle arterie vertebrali bilaterali, nonché pazienti con malattia aterosclerotica intracranica da moderata a grave come si vede nell'angiogramma TC (CTA) della testa e del collo. Per ridurre al minimo i fattori confondenti, saranno esclusi anche i pazienti con malattia vascolare periferica da moderata a grave nota o malattia coronarica sintomatica con anamnesi di stent o bypass coronarico. Anche i detenuti e le donne in gravidanza saranno esclusi da questo studio. Verrà valutata l'espressione differenziale dei microRNA esosomiali nei pazienti con LVO acuto rispetto ai controlli sani. Inoltre, un neuroradiologo classificherà la circolazione collaterale cerebrale come (i) buona o (ii) scarsa, dopo aver esaminato attentamente gli studi CTA e CT perfusion (CTP) in ciascun paziente utilizzando un metodo di punteggio collaterale convalidato. Trenta pazienti con occlusione dei grandi vasi saranno arruolati in questo studio oltre a 15 controlli sani (n=45). I campioni di sangue verranno prelevati in 4 diversi punti temporali dall'insorgenza dei sintomi per ciascun paziente: (i) 0-6 ore, (ii) 6-12 ore, (iii) 12-24 ore e (iv) 5-7 giorni. Verrà inoltre valutata l'espressione differenziale di MiRNA tra i pazienti con diversi gradi collaterali

Poiché il processo di maturazione collaterale inizia probabilmente poco dopo i cambiamenti emodinamici indotti da LVO, i ricercatori prevedono di raccogliere il primo campione entro 0-6 ore. Durante le prime 24 ore verranno raccolti tre campioni di sangue per aumentare le possibilità di catturare il profilo di espressione del miRNA all'inizio del processo di rimodellamento collaterale. I profili di miRNA di questi pazienti saranno quindi analizzati e confrontati con quelli di volontari sani. Inoltre, verrà effettuato un confronto tra pazienti con grado collaterale cerebrale buono e scarso. Analizzeremo i profili di miRNA di questi pazienti utilizzando i metodi descritti di seguito.

Isolamento e caratterizzazione dell'esosoma: la quantificazione del numero e delle dimensioni dell'esosoma sarà effettuata utilizzando un NanoSight NS300 (Nanosight, Regno Unito) presso l'OSU CCC Analytical Cytometry Core come descritto in precedenza. In breve, gli esosomi saranno isolati dal plasma privo di cellule utilizzando il Total Exosome Isolation Kit (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore. Gli esosomi saranno sospesi in tampone PBS e conservati a 4°C per un massimo di 7 giorni. La sospensione di esosomi verrà quindi diluita per ottenere una concentrazione di lavoro compresa tra 2 x 108 e 8 x 108 per l'uso in NanoSight NS300, dopodiché gli esosomi verranno contati e dimensionati11.

Isolamento dell'RNA totale: L'RNA totale sarà isolato dagli esosomi sospesi in PBS usando il Circulating Nucleic Acid Extraction Kit (Qiagen) come precedentemente descritto12. La contaminazione del DNA sarà mitigata attraverso l'uso del set di DNasi senza RNasi di Qiagen. L'RNA sarà concentrato e purificato utilizzando il kit RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen) come descritto.

NanoString Assay: il sistema multiplexato di nanoString nCounter miRNA (nanoString Technologies) presso la Ohio State University CCC Genomics Shared Resource verrà utilizzato per la profilazione dell'espressione di miRNA come descritto12. L'RNA totale (100 ng) isolato dagli esosomi sarà utilizzato come materiale di input. Piccoli campioni di RNA saranno preparati legando uno specifico tag di DNA sull'estremità 3' dei miRNA maturi secondo le istruzioni del produttore (nanoString Technologies). Questi tag normalizzeranno le temperature di fusione dei miRNA e forniranno l'identificazione per ciascuna specie di miRNA nel campione. I tag in eccesso verranno lavati via e il materiale risultante ibridato con miRNA: sonde reporter nCounter specifiche per tag. Le sonde ibridate saranno quindi purificate e immobilizzate su una cartuccia rivestita di streptavidina utilizzando la nCounter Prep Station (nanoString Technologies). L'analizzatore digitale nCounter verrà utilizzato per contare i singoli codici a barre fluorescenti e quantificare le molecole di miRNA presenti in ciascun campione.

Normalizzazione e analisi del profilo di espressione di miRNA: il controllo di qualità, la normalizzazione e l'analisi dei dati verranno eseguiti utilizzando il software di analisi nSolver 2.0 (nanoString Technologies) come descritto in precedenza. Il clustering gerarchico dei miRNA identificati tramite la query nanoString sarà condotto utilizzando il software dChip (v 1.3). I miRNA differenzialmente espressi in pazienti con punteggi collaterali buoni o scarsi (come descritto sopra) saranno definiti da una variazione maggiore o minore di 2 volte utilizzando il test di analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) con un livello di significatività di p<0,05 e con correzione per il tasso di false scoperte.

Convalida RT-PCR di miRNA esosomiali: i miRNA selezionati isolati dagli esosomi verranno trascritti al contrario utilizzando il kit di sintesi cDNA universale miRCURY LNA (Exiqon) secondo il protocollo del produttore come descritto in precedenza. I miRNA saranno quantificati mediante PCR in tempo reale utilizzando ExiLENT SYBR Green (Exiqon) su una piattaforma qPCR Mx3000P, con espressione normalizzata a un riferimento di pulizia (es. SNORD44).