Identifikace mikroRNA zapojených do regulace cerebrálního kolaterálu (microRNA)

Budou vyšetřeni pacienti ve věku >18 let, kteří se dostaví na pohotovostní oddělení Wexnerova lékařského centra Ohio State University (OSU) s akutní ischemickou cévní mozkovou příhodou. Výzkumníci budou zahrnovat pacienty s přední cirkulační akutní ischemickou cévní mozkovou příhodou sekundární k náhlé akutní okluzi velkých cév (LVO). Zdravé subjekty budou použity jako kontroly pro hodnocení miRNA specifických pro populaci iktu. Protože hemodynamicky významná preexistující stenóza může vést ke změně exprese miRNA, vyšetřovatelé vyloučí pacienty s >50% stenózou vnitřní krkavice (ICA), >50% stenózou bilaterálních vertebrálních tepen, stejně jako pacienty se středně těžkou až těžkou intrakraniální aterosklerotickou chorobou jak je vidět na CT angiogramu (CTA) hlavy a krku. Aby se minimalizovaly zmatky, budou vyloučeni také pacienti se známým středně závažným až závažným onemocněním periferních cév nebo symptomatickým onemocněním koronárních tepen s anamnézou stentu nebo bypassu koronární tepny. Z této studie budou také vyloučeni vězni a těhotné ženy. Bude hodnocena rozdílná exprese exosomálních mikroRNA u pacientů s akutním LVO ve srovnání se zdravými kontrolami. Neuroradiolog navíc po pečlivém přezkoumání studií CTA a CT perfuze (CTP) u každého pacienta za použití validované metody hodnocení kolaterálu ohodnotí cerebrální kolaterální oběh jako (i) dobrý nebo (ii) špatný. Kromě 15 zdravých kontrol (n=45) bude do této studie zařazeno 30 pacientů s okluzí velkých cév. Vzorky krve budou každému pacientovi odebrány ve 4 různých časových bodech od nástupu příznaků: (i) 0-6 hodin, (ii) 6-12 hodin, (iii) 12-24 hodin a (iv) 5-7 dní. Diferenciální exprese MiRNA bude také hodnocena mezi pacienty s různým stupněm kolaterálu

Protože proces kolaterálního zrání pravděpodobně začíná krátce po hemodynamických změnách vyvolaných LVO, vyšetřovatelé plánují odebrat první vzorek během 0-6 hodin. Během prvních 24 hodin budou odebrány tři vzorky krve, aby se zvýšila šance na zachycení profilu exprese miRNA na začátku procesu remodelace kolaterálu. Profily miRNA těchto pacientů budou poté analyzovány a porovnány se zdravými dobrovolníky. Kromě toho bude provedeno srovnání mezi pacienty s dobrým a špatným stupněm mozkové kolaterály. Pomocí níže popsaných metod budeme analyzovat profily miRNA těchto pacientů.

Izolace a charakterizace exozomů: Kvantifikace počtu a velikosti exozomů bude provedena pomocí NanoSight NS300 (Nanosight, UK) v OSU CCC Analytical Cytometry Core, jak bylo popsáno dříve. Stručně, exosomy budou izolovány z bezbuněčné plazmy pomocí Total Exosome Isolation Kit (Invitrogen) podle pokynů výrobce. Exozomy budou suspendovány v PBS pufru a skladovány při 4 °C po dobu až 7 dnů. Suspenze exosomů bude poté zředěna tak, aby se dosáhlo pracovní koncentrace mezi 2 x 108 - 8 x 108 pro použití v NanoSight NS300, načež se exozomy spočítají a určí jejich velikost11.

Izolace celkové RNA: Celková RNA bude izolována z exozomů suspendovaných v PBS pomocí soupravy pro extrakci cirkulujících nukleových kyselin (Qiagen), jak bylo popsáno výše12. Kontaminace DNA bude zmírněna použitím sady DNázy bez RNázy společnosti Qiagen. RNA bude koncentrována a purifikována pomocí RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen), jak je popsáno.

NanoString Assay: Multiplexní miRNA systém nanoString nCounter (nanoString Technologies) na The Ohio State University CCC Genomics Shared Resource bude použit pro profilování exprese miRNA, jak je popsáno12. Jako vstupní materiál bude použita celková RNA (100 ng) izolovaná z exozomů. Malé vzorky RNA budou připraveny ligací specifické DNA značky na 3'-konec zralých miRNA podle pokynů výrobce (nanoString Technologies). Tyto značky budou normalizovat teploty tání miRNA a poskytnout identifikaci pro každý druh miRNA ve vzorku. Přebytečné značky budou smyty a výsledný materiál hybridizován s miRNA:tag-specifickými reportérovými sondami nCounter. Hybridizované sondy pak budou purifikovány a imobilizovány na kazetě potažené streptavidinem pomocí nCounter Prep Station (nanoString Technologies). Digitální analyzátor nCounter bude použit k počítání jednotlivých fluorescenčních čárových kódů a kvantifikaci molekul miRNA přítomných v každém vzorku.

Normalizace a analýzy expresního profilu miRNA: Kontrola kvality, normalizace a analýzy dat budou prováděny pomocí analytického softwaru nSolver 2.0 (nanoString Technologies), jak bylo popsáno dříve. Hierarchické shlukování miRNA identifikovaných pomocí dotazu nanoString bude provedeno pomocí softwaru dChip (v 1.3). Diferenciálně exprimované miRNA u pacientů s dobrým nebo špatným kolaterálním skóre (jak je popsáno výše) budou definovány větší nebo menší než dvojnásobnou změnou pomocí testu jednosměrné analýzy rozptylu (ANOVA) s hladinou významnosti p<0,05 a s korekcí na míru falešných objevů.

RT-PCR Validace exosomálních miRNA: Vybrané miRNA izolované z exozomů budou reverzně transkribovány pomocí miRCURY LNA Universal cDNA syntézní soupravy (Exiqon) podle protokolu výrobce, jak je popsáno výše. miRNA budou kvantifikovány pomocí PCR v reálném čase pomocí ExiLENT SYBR Green (Exiqon) na platformě Mx3000P qPCR, s expresí normalizovanou na referenční referenci (tj. SNORD44).