Aivojen vakuussääntelyyn osallistuvien mikroRNA:iden tunnistaminen (microRNA)

Yli 18-vuotiaat potilaat, jotka saapuvat Ohio State Universityn (OSU) Wexner Medical Centerin ensiapuosastolle, joilla on akuutti iskeeminen aivohalvaus, seulotaan. Tutkijoiden joukossa on potilaita, joilla on etuveren akuutti iskeeminen aivohalvaus, joka on toissijainen äkillisen akuutin suuren verisuonen tukkeuman (LVO) seurauksena. Terveitä koehenkilöitä käytetään kontrolleina aivohalvauspopulaatiolle spesifisten miRNA:iden arvioimiseksi. Koska hemodynaamisesti merkittävä ahtauma voi johtaa miRNA:n ilmentymisen muutoksiin, tutkijat sulkevat pois potilaat, joilla on > 50 % sisäisen kaulavaltimon (ICA) ahtauma, > 50 % kahdenvälisten nikamavaltioiden ahtauma sekä potilaat, joilla on kohtalainen tai vaikea kallonsisäinen ateroskleroottinen sairaus. kuten näkyy pään ja kaulan CT-angiogrammissa (CTA). Hämmennysten minimoimiseksi poissuljetaan myös potilaat, joilla on tunnetusti kohtalainen tai vaikea perifeerinen verisuonisairaus tai oireinen sepelvaltimotauti ja joilla on aiemmin ollut stentti tai sepelvaltimon ohitusleikkaus. Myös vangit ja raskaana olevat naiset suljetaan pois tästä tutkimuksesta. Eksosomaalisten mikroRNA:iden erilainen ilmentyminen potilailla, joilla on akuutti LVO, verrattuna terveisiin kontrolleihin, arvioidaan. Lisäksi neuroradiologi arvioi aivojen kollateraaliverenkierron (i) hyväksi tai (ii) huonoksi tarkasteltuaan huolellisesti kunkin potilaan CTA- ja CT-perfuusiotutkimukset (CTP) käyttäen validoitua pisteytysmenetelmää. Tähän tutkimukseen otetaan 30 potilasta, joilla on suuri verisuonen tukkeuma, 15 terveen kontrollin (n = 45) lisäksi. Verinäytteet otetaan 4 eri ajankohdassa oireiden alkamisesta kullekin potilaalle: (i) 0-6 tuntia, (ii) 6-12 tuntia, (iii) 12-24 tuntia ja (iv) 5-7 päivää. Differentiaalista MiRNA-ilmentymistä arvioidaan myös potilaiden välillä, joilla on vaihtelevia sivuvaikutuksia

Koska vakuuksien kypsymisprosessi alkaa todennäköisesti pian LVO:n aiheuttamien hemodynaamisten muutosten jälkeen, tutkijat suunnittelevat keräävänsä ensimmäisen näytteen 0–6 tunnin kuluessa. Ensimmäisen 24 tunnin aikana kerätään kolme verinäytettä, jotta voidaan lisätä miRNA:n ilmentymisprofiilin kaappaamisen todennäköisyyttä sivun uudelleenmuotoiluprosessin alussa. Näiden potilaiden miRNA-profiilit analysoidaan ja verrataan terveisiin vapaaehtoisiin. Lisäksi vertaillaan potilaita, joilla on hyvä ja huono aivoinfarktin luokka. Analysoimme näiden potilaiden miRNA-profiilit alla kuvattujen menetelmien avulla.

Eksosomien eristäminen ja karakterisointi: Eksosomien lukumäärän ja koon kvantifiointi suoritetaan käyttämällä NanoSight NS300:aa (Nanosight, UK) OSU CCC Analytical Cytometry Core -keskuksessa, kuten aiemmin on kuvattu. Lyhyesti sanottuna eksosomit eristetään soluttomasta plasmasta käyttämällä Total Exosome Isolation Kit -sarjaa (Invitrogen) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Eksosomit suspendoidaan PBS-puskuriin ja säilytetään 4 °C:ssa enintään 7 päivää. Eksosomisuspensio laimennetaan sitten työpitoisuuden saavuttamiseksi välillä 2 x 108 - 8 x 108 käytettäväksi NanoSight NS300:ssa, minkä jälkeen eksosomit lasketaan ja niiden koko määritetään11.

Kokonais-RNA:n eristäminen: Kokonais-RNA eristetään PBS:ään suspendoiduista eksosomeista käyttämällä Circulating Nucleic Acid Extraction Kit (Qiagen) -pakkausta, kuten aiemmin on kuvattu12. DNA-kontaminaatiota vähennetään käyttämällä Qiagenin RNaasi-vapaata DNaasi-sarjaa. RNA konsentroidaan ja puhdistetaan käyttämällä RNeasy MinElute Cleanup Kit -sarjaa (Qiagen) kuvatulla tavalla.

NanoString Assay: Multipleksoitua nanoString nCounter miRNA -järjestelmää (nanoString Technologies) Ohion osavaltion yliopiston CCC Genomics Shared Resourcessa käytetään miRNA:n ilmentymisen profilointiin kuvatulla tavalla12. Eksosomeista eristettyä kokonais-RNA:ta (100 ng) käytetään syöttömateriaalina. Pienet RNA-näytteet valmistetaan liittämällä spesifinen DNA-merkki kypsän miRNA:n 3'-päähän valmistajan ohjeiden mukaisesti (nanoString Technologies). Nämä tunnisteet normalisoivat miRNA:iden sulamislämpötilat ja tunnistavat jokaisen näytteen miRNA-lajin. Ylimääräiset merkit pestään pois ja tuloksena oleva materiaali hybridisoidaan miRNA:tag-spesifisten nCounter-reportterikoettimien kanssa. Hybridisoidut koettimet puhdistetaan ja immobilisoidaan streptavidiinilla päällystetylle patruunalle käyttämällä nCounter Prep Station -asemaa (nanoString Technologies). nCounter Digital Analyzeria käytetään yksittäisten fluoresoivien viivakoodien laskemiseen ja kussakin näytteessä olevien miRNA-molekyylien kvantifiointiin.

miRNA-ilmentymisprofiilin normalisointi ja analyysit: Laadunvalvonta, normalisointi ja data-analyysit suoritetaan käyttämällä nSolver 2.0 -analyysiohjelmistoa (nanoString Technologies) aiemmin kuvatulla tavalla. NanoString-kyselyllä tunnistettujen miRNA:iden hierarkkinen klusterointi suoritetaan dChip (v 1.3) -ohjelmistolla. Erilaisesti ilmentyneet miRNA:t potilailla, joilla on hyvät tai huonot lisäpisteet (kuten yllä on kuvattu), määritellään yli tai alle 2-kertaisella muutoksella käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA) merkitsevyystasolla p<0,05 ja virheellisen havainnoinnin korjauksella.

Eksosomaalisten miRNA:iden RT-PCR-validointi: Valitut eksosomeista eristetyt miRNA:t käänteiskirjoitetaan käyttämällä miRCURY LNA Universal cDNA -synteesipakkausta (Exiqon) valmistajan protokollan mukaisesti, kuten aiemmin on kuvattu. miRNA:t kvantifioidaan reaaliaikaisella PCR:llä käyttämällä ExiLENT SYBR Greeniä (Exiqon) Mx3000P qPCR-alustalla, ja ekspressio normalisoidaan taloudenhoitoreferenssiin (ts. SNORD44).